循環(huán)腫瘤細胞致腫瘤血行轉移研究進展

喬雪峰，張玉娟，崔 巍

1中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科， 北京 1007302北京煤炭總醫(yī)院檢驗科， 北京 100028

·綜 述·

循環(huán)腫瘤細胞致腫瘤血行轉移研究進展

喬雪峰1,2，張玉娟1，崔 巍1

1中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科， 北京 1007302北京煤炭總醫(yī)院檢驗科， 北京 100028

循環(huán)腫瘤細胞；血行轉移

眾所周知，腫瘤轉移是造成腫瘤患者死亡的重要原因之一。原發(fā)腫瘤釋放成千上萬的腫瘤細胞入血，但僅有不足0.01%的循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)能夠在外周血存活并形成轉移[1]，CTCs檢測在肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多種癌癥中具有診斷、判斷預后等價值[2]。以往認為腫瘤轉移發(fā)生在原發(fā)腫瘤形成后，經(jīng)典的腫瘤轉移經(jīng)過原發(fā)灶腫瘤、腫瘤細胞播散入血并在外周血存活、組織侵襲、形成轉移灶等階段[3]；但最近研究發(fā)現(xiàn)，上皮細胞播散可發(fā)生于癌前病變極早期，在形成明顯的原發(fā)灶之前，上皮細胞或已脫落入血并在遠處定植[4]。腫瘤細胞脫落入血，CTCs在進行血行轉移的過程中受到宿主細胞和血液微環(huán)境等多方面因素的調(diào)控，需要不斷獲得適應微環(huán)境的生存能力，因此認識和探討CTCs的血行轉移調(diào)控機制能夠為臨床監(jiān)測腫瘤播散轉移提供重要價值。

循環(huán)腫瘤細胞存活于外周血

研究表明，上皮來源的腫瘤細胞脫離原發(fā)灶進入血液循環(huán)后，會發(fā)生細胞性質(zhì)改變，一部分上皮性腫瘤細胞轉變?yōu)榫哂小奥巍碧卣鞯拈g充質(zhì)細胞[5]，發(fā)生上皮間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，從而失去與鄰接上皮細胞間的聯(lián)系，并進一步克服血流剪切力及免疫系統(tǒng)等各種微環(huán)境因素的破壞而存活下來。在此階段，血小板對CTCs起到了重要保護作用[6]。

CTCs入血0～2 min內(nèi)即可與血小板發(fā)生直接或間接的相互作用。首先，CTCs通過高表達組織因子(tissue factor，TF)而激活凝血系統(tǒng)，促使血小板向其聚集[7]；其次，CTCs表面的整合素αvβ3及活化的血小板表面的αIIbβ3均能結合纖維蛋白，三者形成腫瘤細胞-纖維蛋白-血小板聚集體；再次，CTCs可借助P-選擇素配體與血小板表面的P-選擇素受體相結合，誘導血小板向其聚集[8]。血小板向CTCs聚集能為后者提供物理屏障，從而可有效避免自然殺傷(natural killer，NK)細胞對CTCs的免疫清除，同時還可賦予CTCs宿主MHC I類分子特性，干擾NK細胞丟失自我(missing-self)而殺傷自身；血小板釋放的轉化生長因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)和血小板生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)，可分別下調(diào)NK細胞NKG2D免疫受體和抑制NK細胞殺傷作用[9]。腫瘤細胞的促凝活性有助于其在循環(huán)中播散，腫瘤接種前靜脈注射重組鼠源性組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)能抑制83%的CTCs誘導的腫瘤轉移[10]；低分子量肝素能抑制P-選擇素及其配體結合，削弱血小板-腫瘤細胞間的相互聚集，從而抑制腫瘤轉移[11]。研究亦發(fā)現(xiàn)，循環(huán)腫瘤細胞簇(CTC clusters)及黏附于其他細胞的CTCs，與單個CTCs相比，其存活率及活性均明顯增高。但目前CTCs分離計數(shù)方法的處理過程，會分散聚集狀態(tài)下的CTCs，導致CTCs某些生物信息丟失[12]。

血小板除對CTCs具有保護作用外，還具有促進腫瘤轉移的潛能。多種腫瘤患者的高血小板計數(shù)及血小板凝聚與患者生存期降低具有相關性[6]，血小板α-顆粒儲存了大量促血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、內(nèi)皮細胞生長因子(endothelial cell growth factor，EGF)、PDGF、胰島素樣生長因子1和2 (insulin-like growth factor- 1/- 2，IGF- 1/- 2)等，促進內(nèi)皮細胞的活化，并直接募集骨髓來源樹突狀細胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs)，促進腫瘤生長[13]，對血小板和腫瘤細胞表面的整合素進行封閉或基因清除能抑制腫瘤轉移。

肺轉移癌模型研究亦發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞和骨髓來源的免疫細胞亞群均有促進腫瘤細胞存活和增殖的作用，如CTCs表達血管細胞黏附分子- 1(vascular cell adhesion molecule- 1，VCAM- 1)與巨噬細胞表達的整合素α4結合，能保護CTCs免受腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing-ligand，TRAIL)的破壞，促進CTCs的存活與轉移[14]。

循環(huán)腫瘤細胞浸潤

CTCs入血后即在中性粒細胞及單核巨噬細胞的幫助下，與血管內(nèi)皮細胞建立初始聯(lián)系，以利于后續(xù)的轉移。目前，關于外周血管捕獲腫瘤細胞的假說有兩種，其一為物理捕獲假說[15]，即腫瘤細胞直徑大多為20～30 μm，當脫落入血的CTCs首次經(jīng)過循環(huán)下游內(nèi)徑約8 μm左右的毛細血管床時能被輕易捕獲，且CTCs之間及其與宿主細胞間的相互聚集會進一步促進對CTCs的捕獲；臨床上結直腸癌大多轉移至肝臟，乳腺癌常轉移至肺，這是由腫瘤所在部位的循環(huán)模式所決定的。研究亦發(fā)現(xiàn)，CTCs除被毛細血管捕獲外，還能被內(nèi)徑較大的血管所捕獲，提示CTCs與內(nèi)皮細胞間初始聯(lián)系的建立還存在其他機制，即黏附分子介導假說[16]。該假說認為，CTCs通過其表達的黏附分子與血細胞相互作用從而獲得向內(nèi)皮細胞滾動、黏附及隨后外侵的能力。這兩種假說亦可同時存在，即CTCs入血后短時間內(nèi)出現(xiàn)的捕獲大多是被動的，遵循物理捕獲假說；而在宿主非腫瘤細胞協(xié)助下，CTCs與血管內(nèi)皮細胞間形成的特異、持久的黏附則可能遵循后一種假說。研究發(fā)現(xiàn)，在最初24 h內(nèi)，初始捕獲于腦部毛細血管的黑色素瘤細胞或肺癌細胞會反復幾次進入或離開該捕獲位點，此時腫瘤細胞死亡率非常高，能否維持于初始捕獲位點并完成隨后浸潤，取決于腫瘤細胞的自身特性或與其自身相關的血栓、血小板和白細胞等的相互作用[17]。

原發(fā)腫瘤分泌的可溶性因子會先于CTCs到達預捕獲位點，增強該位點局部的通透性，并可誘導BMDCs向轉移靶器官募集，形成轉移前微環(huán)境(premetastatic niches)，以利于腫瘤細胞的定居和生長[18]。干擾腫瘤細胞對宿主促轉移細胞的募集及相互作用，能明顯抑制腫瘤轉移[8]。原發(fā)腫瘤還會觸發(fā)炎癥反應，引起內(nèi)皮細胞和血小板活化，動員各種類型BMDCs細胞，包括非成熟髓系細胞、中性粒細胞及單核細胞，促進腫瘤轉移[18- 19]，髓系細胞釋放白細胞介素(interleukin，IL)- 1α、IL- 1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，介導內(nèi)皮細胞活化，進而表達E-選擇素(E-selectin)、P-選擇素(P-selectin)、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule- 1，ICAM- 1)或VCAM- 1，上述細胞黏附分子與CTCs表面相應配體結合，進而促進CTCs的滾動與黏附。

體外研究亦表明，腫瘤細胞活化內(nèi)皮細胞的過程是P-選擇素依賴且需要血小板、中性粒細胞及腫瘤細胞同時存在，如結直腸癌細胞會聯(lián)合血小板和中性粒細胞共同活化內(nèi)皮細胞[20]。黏附于內(nèi)皮細胞的活化血小板可借助其表面的P-選擇素與白細胞表面的P-選擇素糖蛋白配體-1相結合，募集白細胞并活化白細胞整合素β2[21]，后者有助于與血小板整合素αIIbβ3結合的纖維蛋白原相結合，穩(wěn)定血小板-白細胞間的相互作用。白細胞在腫瘤轉移的早期階段起促進作用，血管內(nèi)捕獲位點若不能誘導L-選擇素配體的表達，則腫瘤轉移會減弱，基因或藥物清除單核/巨噬細胞系細胞會減少腫瘤轉移[22]。而小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在注射黑色素瘤細胞后1 h，再經(jīng)尾靜脈注射中性粒細胞，24 h后肺內(nèi)CTCs明顯增加[23]。但亦有研究顯示，分離自荷瘤小鼠，分子標記為CD11b+Ly- 6G+MMP- 9+的腫瘤攜帶中性粒細胞(tumor-entrained neutrophils，TENs)可產(chǎn)生高水平的過氧化氫，殺死腫瘤細胞，對抗乳腺癌細胞在肺中的轉移播散[24]。可見，中性粒細胞具有促進及抑制腫瘤轉移的雙重作用，其趨向取決于其所處的微環(huán)境，如聚集于腫瘤細胞周圍的血小板可釋放TGF-β封鎖TENs的活性而促進腫瘤轉移[25]。

循環(huán)腫瘤細胞轉移

腫瘤細胞轉移效率依賴于其自身行為和宿主組織特性。腫瘤細胞入血后1～3 d發(fā)生轉移，CTCs與血小板間的相互作用會加快其轉移的速度。血小板源性TGF-β與血小板-CTCs的直接接觸會激活CTCs TGF-β/Smad 和NF-κB信號通路[25]，引起腫瘤細胞發(fā)生EMT，使得CTCs上皮標志表達基因受抑而間質(zhì)細胞標志基因表達活躍，由此增強外侵及播散能力；當CTCs到達轉移靶器官后，再經(jīng)過間質(zhì)上皮轉化(mesenchymal-epithelial transition,MET)，繼續(xù)增殖進而形成腫瘤轉移灶[26]。參與EMT過程的幾種生長因子中TGF-β的研究最為廣泛，清除血小板特異性TGF-β會破壞腫瘤細胞外侵，降低腫瘤轉移[27]。上述CTCs中NF-κB信號通路激活還能促進促炎癥趨化因子2(chemokine C ligend 2，CCL2)的表達，募集單核細胞[19]，參與腫瘤轉移。

同時，各種促轉移基因的表達能改變機體的微環(huán)境，增強血小板活化的腫瘤細胞侵襲能力[25]，如與血管及細胞外基質(zhì)重塑相關基因(EREG, COX2, MMP1, MMP2)表達上調(diào)促進CTCs的外侵和轉移[28]，高表達血管生成素樣蛋白ANGPTL4和血管內(nèi)皮生長因子VEGF-A的CTCs更容易形成肺轉移[29]。并且轉移相關巨噬細胞(標記為F4/80+CD11b+Gr1-)分泌VEGF-A，可增加血管內(nèi)皮細胞通透性，促進腫瘤細胞外侵、播散及生長[30]。結直腸癌實驗性轉移模型發(fā)現(xiàn)，CTCs來源的CCL2可直接向內(nèi)皮細胞表達的CCR2傳遞信號，增加血管通透性，促進CTCs的轉移，且完全獨立于髓細胞的作用[31]。轉移位點成纖維細胞表達的骨膜蛋白periostin和細胞黏合素tenas-cin C是轉移成功所必需的[32]，TGF-β與這2種蛋白的表達增強有關，再次提示腫瘤細胞或宿主細胞表達的TGF-β對腫瘤轉移啟動的重要性。

總之，腫瘤細胞脫落入血并在外周血中存活以及外侵轉移受細胞本身和微環(huán)境的多重因素影響和調(diào)控，包括血小板-CTCs、腫瘤細胞-內(nèi)皮細胞、單核巨噬細胞-內(nèi)皮細胞之間的相互調(diào)控。以上假說多基于動物實驗，而作為現(xiàn)階段腫瘤血行轉移研究的標準模式，動物模型的建立存在些許不足，如此類方法研究腫瘤細胞血行轉移的過程缺乏原發(fā)腫瘤，CTCs入血方式不是原發(fā)腫瘤脫落而是人為的直接靜脈注射，CTCs在循環(huán)中停留時間相對較短等。因此，對CTCs與腫瘤轉移的認識不可避免地存在局限性，結論是否適用于人體腫瘤等尚需更多臨床試驗性研究驗證與解答。隨著實驗技術的進展，相信在不遠的將來，人類終將揭開腫瘤轉移過程的神秘面紗，腫瘤亦將不再可怕。

[1]Rhim AD, Mirek ET, Aiello NM, et al. EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation[J]. Cell, 2012,148:349- 361.

[2]Chen Q, Ge F, Cui W, et al. Lung cancer circulating tumor cells isolated by the EpCAM-independent enrichment strategy correlate with Cytokeratin 19-derived CYFRA21- 1 and pathological staging[J]. Clin Chim Acta, 2013,419:57- 61.

[3]Joyce JA, Pollard JW. Microenvironmental regulation of metastasis[J]. Nat Rev Cancer,2009,9:239- 252.

[4]Kang Y, Pantel K. Tumor cell dissemination: emerging biological insights from animal models and cancer patients[J]. Cancer Cell, 2013,23:573- 581.

[5]Yu M, Bardia A, Wittner BS, et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition[J]. Science, 2013,339:580- 584.

[6]Gay LJ, Felding-Habermann B. Contribution of platelets to tumour metastasis[J]. Nat Rev Cancer, 2011,11:123- 134.

[7]Liu Y, Jiang P, Capkova K, et al. Tissue factor-activated coagulation cascade in the tumor microenvironment is critical for tumor progression and an effective target for therapy[J]. Cancer Res, 2011,71:6492- 6502.

[8]Erpenbeck L, Schon MP. Deadly allies: the fatal interplay between platelets and metastasizing cancer cells[J]. Blood, 2010,115:3427- 3436.

[9]Lyman GH, Khorana AA. Cancer, clots and consensus: new understanding of an old problem[J]. J Clin Oncol, 2009,27:4821- 4826.

[10]Amirkhosravi A, Meyer T, Amaya M, et al. The role of tissue factor pathway inhibitor in tumor growth and metastasis[J]. Semin Thromb Hemost, 2007,33:643- 652.

[11]Bendas G, Borsig L. Cancer cell adhesion and metastasis: selectins, integrins, and the inhibitory potential of heparins[J]. Int J Cell Biol, 2012,2012:676, 731.

[12]楊卓，張玉娟，陳倩，等. 循環(huán)腫瘤細胞檢測及其特性[J]. 協(xié)和醫(yī)學雜志, 2013,4:191- 194.

[13]Massberg S, Konrad I, Schurzinger K, et al. Platelets secrete stromal cell-derived factor 1alpha and recruit bone marrow-derived progenitor cells to arterial thrombi in vivo[J]. J Exp Med, 2006,203:1221- 1233.

[14]Chen Q, Zhang XH, Massague J. Macrophage binding to receptor VCAM-1 transmits survival signals in breast cancer cells that invade the lungs[J]. Cancer Cell, 2011,20:538- 549.

[15]Valastyan S, Weinberg RA. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms[J]. Cell, 2011,147:275- 292.

[16]Stanger BZ, Kahn ML. Platelets and tumor cells: a new form of border control[J]. Cancer Cell, 2013,24:9- 11.

[17]Kienast Y, von Baumgarten L, Fuhrmann M, et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation[J]. Nat Med, 2010,16:116- 122.

[18]Deng J, Liu Y, Lee H, et al. S1PR1-STAT3 signaling is crucial for myeloid cell colonization at future metastatic sites[J]. Cancer Cell, 2012,21:642- 654.

[19]Qian BZ, Li J, Zhang H, et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis[J]. Nature, 2011,475:222- 225.

[20]Laubli H, Spanaus KS, Borsig L. Selectin-mediated activation of endothelial cells induces expression of CCL5 and promotes metastasis through recruitment of monocytes[J]. Blood, 2009,114:4583- 4591.

[21]Dole VS, Bergmeier W, Mitchell HA, et al. Activated platelets induce Weibel-Palade-body secretion and leukocyte rolling in vivo: role of P-selectin[J]. Blood, 2005,106:2334- 2339.

[22]Gil-Bernabe AM, Ferjancic S, Tlalka M, et al. Recruitment of monocytes/macrophages by tissue factor-mediated coagulation is essential for metastatic cell survival and premetastatic niche establishment in mice[J]. Blood, 2012,119:3164- 3175.

[23]Huh SJ, Liang S, Sharma A, et al. Transiently entrapped circulating tumor cells interact with neutrophils to facilitate lung metastasis development[J]. Cancer Res, 2010,70:6071- 6082.

[24]Granot Z, Henke E, Comen EA, et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung[J]. Cancer Cell, 2011,20:300- 314.

[25]Labelle M, Begum S, Hynes RO. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis[J]. Cancer Cell, 2011,20:576- 590.

[26]Kalluri R, Weinberg RA. The basics of epithelial-mesenchymal transition[J]. J Clin Invest, 2009,119:1420- 1428.

[27]Nawshad A, Lagamba D, Polad A, et al. Transforming growth factor-beta signaling during epithelial-mesenchymal transformation: implications for embryogenesis and tumor metastasis[J]. Cells Tissues Organs, 2005,179:11- 23.

[28]Gupta GP, Nguyen DX, Chiang AC, et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis[J]. Nature, 2007,446:765- 770.

[29]Weis S, Cui J, Barnes L, et al. Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis[J]. J Cell Biol, 2004,167:223- 229.

[30]Qian B, Deng Y, Im JH, et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth[J]. PLoS One,2009,4:e6562.

[31]Wolf MJ, Hoos A, Bauer J, et al. Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway[J]. Cancer Cell, 2012,22:91- 105.

[32]Oskarsson T, Acharyya S, Zhang XH, et al. Breast cancer cells produce tenascin C as a metastatic niche component to colonize the lungs[J]. Nat Med, 2011,17:867- 874.

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1674-9081(2014)03-0331-04

10.3969/j.issn.1674-9081.2014.03.017

2014- 04- 29)