老年2型糖尿病患者血清膽固醇酯脂肪酸檢測

禹松林，周偉燕，楊睿悅，李紅霞，張順利，張天嬌，趙海建，張傳寶，王 抒，陳文祥，董 軍

1中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院檢驗科， 北京 1007302衛生部臨床檢驗中心生化室， 北京 1007303衛生部北京醫院老年醫學研究所生化室， 北京 100730

·論 著·

老年2型糖尿病患者血清膽固醇酯脂肪酸檢測

禹松林1，周偉燕2，楊睿悅3，李紅霞3，張順利2，張天嬌2，趙海建2，張傳寶2，王 抒3，陳文祥2，董 軍3

1中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院檢驗科， 北京 1007302衛生部臨床檢驗中心生化室， 北京 1007303衛生部北京醫院老年醫學研究所生化室， 北京 100730

目的 探討老年2型糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者血清膽固醇酯脂肪酸及相關生化指標變化情況。方法 研究納入2012年8月至12月北京醫院老年體檢志愿者145例(年齡≥60歲)，包括確診為2型DM患者(DM組)73例和健康對照者(對照組)72名，抽取空腹靜脈血。用液相色譜串聯質譜法測定血清11種主要膽固醇酯脂肪酸，計算各脂肪酸脫氫酶及脂肪酸碳鏈延長酶活性；同時用自動生化分析儀測定空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、載脂蛋白AI(apolipoprotein AI，ApoAI)、載脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)、超敏C反應蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hsCRP)等生化指標，用獨立樣本t檢驗、非參數檢驗、Logistic 回歸等方法對數據進行分析。結果 DM組血清脂肪酸CE14∶0、CE16∶1和CE22∶6顯著低于對照組(P<0.05)，其他脂肪酸成分差異不具有統計學意義；與對照組相比，DM組Δ9-脂肪酸脫氫酶(Δ9-desaturase)活性顯著降低(P=0.001)；Logistic回歸分析顯示CE22∶6和Δ9-desaturase活性對預測DM患病風險具有統計學意義(P<0.05)；校正年齡、性別、體重指數(body mass index，BMI)、TC、TG、 FPG因素影響后，與CE22∶6最低四分位數(CE22∶6≤0.47%)相比，最高四分位數(CE22∶6>0.68%)患DM的比值比為0.27(95%CI: 0.08～0.86，Wald值4.93，P<0.05)；與Δ9-desaturase活性最低四分位數(Δ9-desaturase活性≤0.12)相比，最高四分位數(Δ9-desaturase活性>0.17)患DM的比值比為0.06(95%CI: 0.01～0.22，Wald值17.39，P<0.01)。CE14∶0和CE20∶3與FPG呈顯著負相關(r=-0.18、-0.17，P<0.05)；CE18∶0與BMI、TG呈顯著正相關(r=0.25、0.24，P<0.01)，而與HDL-C和ApoAI呈顯著負相關(r=-0.39、-0.35，P<0.01)；CE20∶3與BMI的相關性最強(r=0.42，P<0.01)。結論 老年2型DM患者血清部分膽固醇酯脂肪酸降低，CE22∶6和Δ9-desaturase可能對2型DM具有保護作用，平衡脂肪酸攝入對防治2型DM具有重要意義。

脂肪酸；2型糖尿病；脂肪酸脫氫酶

MedJPUMCH,2014,5(3):264-269

隨著中國老齡化進程的加速，糖尿病(diabetes mellitus，DM)已成為一項嚴重的公共衛生問題，Xu等[1]發表在JAMA上的文章顯示中國成人DM患病率已上升至 11.6%。實施有效的早期預防干預措施對防治DM至關重要。其中，飲食脂肪性質與DM發生發展密切相關[2]，監測DM患者血清脂肪酸含量變化對指導健康飲食、防治DM具有重要意義。研究指出血清膽固醇酯脂肪酸可反映過去數周飲食脂肪性質，同時可反映攝食脂肪酸在脫氫酶和(或)碳鏈延長酶作用下的內源性轉換，與胰島素抵抗、糖耐量及2型DM相關[3- 4]。本研究通過比較2型DM患者和健康對照者血清中膽固醇酯脂肪酸含量的變化，同時分析血清脂肪酸與2型DM其他危險因素的關系，以期對指導健康飲食、防治糖尿病提供實驗室依據。

對象和方法

對象

2012年8月至12月北京醫院60歲以上老年體檢人群中招募73例DM患者作為DM組，其中男46例，女27例，平均年齡(69±6)歲。入選DM患者均依據《2010中國2型糖尿病防治指南》為2型DM診斷標準，或者臨床已診斷為2型DM。同時在60歲以上體檢人群中選取年齡、性別相匹配的72名表觀健康者作為對照組，其中男45名，女27名，平均年齡(69±7)歲，均無DM病史。入選人群無心血管、高血壓等疾病，2個月內未食用深海魚油等保健品。

儀器、試劑和血清樣品

本研究使用的主要儀器為LC-MS/MS系統，由1200型高效液相色譜儀(Agilent，美國)和API 4000 Triple Quadruple質譜儀(AB SCIEX，美國)組成；其他儀器包括MicroLab 500稀釋器(Hamilton，美國)、XL- 90超速離心機(Beckman Coulter，美國)和7180自動生化分析儀(日立，日本)等。

脂肪酸測定中作參考標準的膽固醇酯脂肪酸購自美國Nuchek Prep. Inc公司。色譜純乙腈、正己烷和異丙醇購自美國Fisher Scientific公司，甲酸銨購自美國Sigma-Aldrich公司，總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、載脂蛋白AI(apolipoprotein AI，ApoAI)、載脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)等試劑盒為日本Sekisui Medical Technologies公司產品。空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)和超敏C反應蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hsCRP)等試劑盒為羅氏(Roche)公司產品。

血清膽固醇酯脂肪酸測定

血清膽固醇酯脂肪酸測定采用本實驗室建立的LC-MS/MS法[5]，首先用異丙醇沉淀血清蛋白，之后將提取物進行液質分析，液相色譜采用Nova-Pak C18色譜柱(4 μm, 2.1 mm×150 mm)，流動相為95% A相(異丙醇∶乙腈∶正己烷=55∶45∶15)和5% B相(含100 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液)，流速為0.3 ml/min，柱溫30 ℃，進樣1 μl。質譜采用電噴霧離子源正離子下多離子反應監測模式，以歸一化法進行定量，共測定血清中11種主要膽固醇酯，包括CE14∶0、CE16∶0、CE16∶1、CE18∶0、CE18∶1、CE18∶2、CE18∶3、CE20∶3、CE20∶4、CE20∶5、CE22∶6。飽和脂肪酸(saturated fatty acids, SFA)=CE14∶0+CE16∶0+CE18∶0，單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids, MUFA)=CE16∶1+CE18∶1，多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)=CE18∶2+CE18∶3+CE20∶3+CE20∶4+CE20∶5+CE22∶6。

生化指標測定

TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoAI、ApoB、FPG和hsCRP用7180自動生化分析儀使用試劑盒進行測定。

脂肪酸相關酶活性測定

根據產物與其對應的前體比率計算得出，Δ9-脂肪酸脫氫酶(Δ9-desaturase)活性=CE16∶1/CE16∶0，Δ6-脂肪酸脫氫酶(Δ6-desaturase)活性=CE18∶3/CE18∶2，Δ5-脂肪酸脫氫酶(Δ5-desaturase)活性=CE20∶4/CE20∶3，碳鏈延長酶(elongase)活性=CE20∶3/CE18∶3。

統計學處理

用SSPS 17.0統計軟件進行統計分析。正態分布樣本比較采用兩獨立樣本t檢驗分析，非正態分布兩獨立樣本比較選用非參數檢驗(Mann-WhitneyU)，對有統計學意義的定量變量按四分位數分為四組，建立模型，用二元Logistic回歸和Wald檢驗分析其與DM的相關性，用雙變量偏相關分析(Spearman相關分析)研究血清脂肪酸和其他生化指標的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

DM組和對照組基本特征

DM組和對照組患者的年齡、體重指數(body mass index，BMI)、 FPG、血脂指標(TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoAI、ApoB)、hsCRP見表1。其中，DM組和對照組BMI、FPG、TC、LDL-C、TG、ApoB、hsCRP之間差異有統計學意義(P<0.05)。

DM組和對照組脂肪酸含量比較

本研究145例檢測對象血清脂肪酸含量多呈非正態分布，因此選用兩獨立樣本的非參數檢驗(Mann-WhitneyU)比較DM組和對照組脂肪酸含量。結果顯示DM組血清CE14∶0、CE16∶1、CE22∶6以及Δ9-desaturase活性顯著低于對照組(P<0.05)，其他各脂肪酸及總SFA、MUFA、PUFA等差異無統計學意義(表2)。

表 1 DM組和對照組人群基本特征±s)

DM：糖尿病；BMI：體重指數；FPG：空腹血糖；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；TG：甘油三酯；ApoAI：載脂蛋白AI；ApoB：載脂蛋白B；hsCRP：超敏C反應蛋白

進一步用Logistic回歸和Wald檢驗分析CE14∶0、CE16∶1、CE22∶6含量以及Δ9-desaturase活性，首先作為定量自變量直接帶入模型評估這4種指標不同水平時2型DM的患病風險，結果顯示CE22∶6和Δ9-desaturase活性對預測2型DM患病風險具有統計學意義(Wald值=8.41,4.97；P<0.01, 0.05)。然后結合實際意義，將CE22∶6濃度及Δ9-desaturase活性根據四分位數分為4組，建立校正性別、年齡因素下的模型1，進一步行Logistic回歸和Wald檢驗分析，結果顯示：CE22∶6與最低四分位數(CE22∶6≤0.47%)相比，最高四分位數(CE22∶6>0.68%)患DM的比值比(odds ratio，OR)為0.27(95%CI：0.09～0.77，Wald值=5.95，P<0.05)；Δ9-desaturase活性與最低四分位數(Δ9-desaturase活性≤0.12)相比，第三(0.14%<Δ9-desaturase活性≤0.17)和最高四分位數(Δ9-desaturase活性>0.17)患DM的OR分別為：0.24(95%CI:0.08～0.70，Wald值=6.81，P<0.01)和0.15(95%CI:0.05～0.44，Wald值=11.82，P<0.01)，CE22∶6和Δ9-desaturase均表現出對DM的保護作用。進一步校正 BMI、FPG、TC、TG后建立模型2進行Logistic回歸分析及Wald檢驗，趨勢更加顯著，并且與最低四分位數相比，CE22∶6的第三和最高四分位數以及Δ9-desaturase活性第二、第三和最高四分位數差異均有統計學意義，且Δ9-desaturase活性隨著四分位數增大患DM的OR值變小(表3)，由此可見CE22∶6含量或Δ9-desaturase活性高對2型DM可能具有保護作用。

表 2 DM組和對照組脂肪酸含量比較[M(Q1～Q3)]

DM：同表1；CE：膽固醇酯；SFA：飽和脂肪酸；MUFA：單不飽和脂肪酸；PUFA：多不飽和脂肪酸；desaturase：脂肪酸脫氫酶；elongase：碳鏈延長酶

表 3 CE22∶6和Δ9-desaturase水平與DM的相關關系

血清膽固醇酯脂肪酸含量與其他生化指標相關性分析

由于樣本中脂肪酸呈非正態分布，因此采用Spearman偏相關分析血清膽固醇酯脂肪酸含量與其他生化指標的關系，結果顯示，CE14∶0和CE20∶3與FPG呈顯著負相關(r=-0.18，-0.17，P均<0.05)；飽和脂肪酸CE18∶0與BMI、TG、ApoB呈顯著正相關(r=0.25，0.24，0.17，P均<0.05)而與HDL-C、ApoAI呈顯著負相關(r=-0.39，-0.35，P均<0.01)；CE20∶3與BMI的相關性最強(r=0.42，P<0.01)；Δ6- desaturase活性與BMI呈顯著正相關(r=0.29，P<0.01)，而Δ5- desaturase活性與BMI和TG均呈顯著負相關(r=-0.33,-0.23，P均<0.01) (表4)。

討 論

本研究中，CE14∶0、CE16∶1和CE22∶6三種脂肪酸以及Δ9-desaturase活性在老年2型DM患者中顯著降低，進一步Logistic回歸分析顯示，CE22∶6和Δ9-desaturase可能對預防2型DM的發生具有積極作用。CE14∶0和CE16∶1可在人體內合成，不是人體必需脂肪酸，因此其含量多少不能真實反映攝入的水平，與DM的發生可能無直接關系，因此在進行Logistic回歸分析后未表現出統計學意義。CE22∶6屬于Omega- 3脂肪酸中的一種，其在體內不能合成，僅可從外源Omega- 3脂肪酸補充劑及深海魚類獲取，體內含量可反映攝食脂肪酸性質。大量的研究顯示Omega- 3脂肪酸可以保護DM心血管、降低2型DM的發生風險[6- 8]，本研究中CE22∶6與2型DM的關系與文獻報道結論一致。SFA、MUFA以及PUFA等未顯示出與2型DM有關。Van Woudenbergh等[3]指出Δ9-desaturase活性降低可能是SFA與2型DM呈正相關的機制。在本研究中，雖未觀察到總SFA有明顯變化，但是Δ9-desaturase活性顯著降低，為Van Woudenbergh提出的2型DM患者SFA向MUFA轉換可能降低提供了很好的證據，且本研究顯示，在校正年齡、性別、BMI、TC、TG、FPG因素之后，Δ9-desaturase活性的第二、第三、最高四分位數與最低四分位數相比，OR值分別為0.30(95%CI:0.09～0.95)、0.09(95%CI: 0.02～0.33)、0.06(95%CI: 0.01～0.22)。以上結果表明，老年2型DM患者具有較低的Δ9-desaturase活性，Δ9-desaturase活性可能是2型DM發病風險的預測因子。

此外，相關性分析顯示飽和脂肪酸CE18∶0與BMI、TG、ApoB等心血管危險因素呈顯著正相關，而與心血管保護因素HDL-C、ApoAI呈顯著負相關，與文獻報道的飽和脂肪酸是心血管疾病發生的危險因素相一致[9]。CE20∶3與BMI和TG呈顯著正相關，但是與FPG呈顯著負相關。CE20∶3屬于Omega- 6脂肪酸，研究顯示Omega- 6脂肪酸與心血管疾病關系不一致，多認為其可降低胰島素抵抗，降低患糖尿病的風險[10- 11]。

表 4 各脂肪酸與其他生化指標的相關系數

BMI、FPG、TC、HDL-C、LDL-C、TG、ApoAI、ApoB、hsCRP：同表1； CE、SFA、MUFA、PUFA、desaturase、elongase：同表2；*P<0.05,**P<0.01

綜上所述，老年2型DM患者血清中部分膽固醇酯脂肪酸顯著降低，CE22∶6和Δ9-desaturase可能對老年2型DM具有保護作用，血清脂肪酸種類與BMI相關，平衡各脂肪酸攝入對防治2型DM具有重要意義。

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Detection of Serum Cholesterol Ester Fatty Acids in the Elderly with Type 2 Diabetes Mellitus

YU Song-lin1, ZHOU Wei-yan2, YANG Rui-yue3, LI Hong-xia3, ZHANG Shun-li2, ZHANG Tian-jiao2,ZHAO Hai-jian2, ZHANG Chuan-bao2, WANG Shu3, CHEN Wen-xiang2, DONG Jun3

1Department of Clinical Laboratory, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College, Beijing 100730, China2Department of Biochemistry, National Center for Clinical Laboratories, Ministry of Health, Beijing 100730, China3Key Laboratory of Geriatrics, Institute of Geriatrics, Ministry of Health, Beijing 100730, China

DONG Jun Tel: 010-85138520, E-mail:jun_dong@263.net

Objective To evaluate the alteration of cholesterol ester fatty acids and related serum biochemical

parameters in elderly patients with type 2 diabetes mellitus(T2DM). Methods Totally 73 T2DM patients(T2DM group) and 72 healthy subjects(control group) (aged ≥60 years) who

health check-ups in Beijing Hospital from August to December in 2012 were recruited and blood samples were collected. Eleven main cholesterol ester fatty acids in serum were determined with liquid chromatography tandem mass spectrometry, and endogenous conversions by desaturases and elongases were estimated from product-to-precursor ratios. Fasting plasma glucose(FPG), total cholesterol(TC), triglyceride(TG), high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C), low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C), apolipoprotein(Apo) AI(ApoAI), ApoB, and high sensitivity C-reactive protein(hsCRP) were analyzed with an automatic biochemistry analyzer and the results were statistically analyzed. Results CE14∶0, CE16∶1 and CE22∶6 in T2DM group were significantly lower than those in the control group(P<0.05), while no significant difference existed between other fatty acid compositions. Δ9-desaturase activity was lower in T2DM group compared with that in control group(P=0.001). After adjusting for age, gender, body mass index(BMI), TC, TG, and FPG，Logistic analysis showed the quartiles of CE22∶6 and Δ9-desaturase activity were associated with risk of type 2 DM, and the odds ratios were 0.27(95%CI: 0.08-0.86, Wald: 4.93,P<0.05)and 0.06(95%CI: 0.01-0.22, Wald:17.39,P<0.01), respectively, for comparison of the top to bottom quartile. Both CE14∶0 and CE20∶3 negatively correlated with FPG(r=-0.18,-0.17,P<0.05); CE18∶0 positively correlated with BMI and TG(r= 0.25, 0.24,P<0.01) and negatively correlated with HDL-C and ApoAI(r=-0.39,-0.35,P<0.01); CE20∶3 positively correlated with BMI, with a correlation coefficient of 0.42(P<0.01). Conclusions Several cholesterol ester fatty acids decrease in elderly T2DM patients. CE22∶6 and Δ9-desaturase may protect against T2DM. An appropriately balanced intake of fatty acids is helpful for the prevention of T2DM in the elderly population.

fatty acids; type 2 diabetes mellitus; desaturase

國家自然科學基金(81171647和81201337)

董 軍 電話：010-85138520，E-mail：jun_dong@263.net

R446

A

1674-9081(2014)03-0264-06

10.3969/j.issn.1674-9081.2014.03.004

2014- 04- 30)