芽孢桿菌混合發酵工藝條件的優化

何華美，李淑珍，陳丹霞，潘進權

（湛江師范學院生命科學與技術學院，廣東湛江524048）

芽孢桿菌混合發酵工藝條件的優化

何華美，李淑珍，陳丹霞，潘進權*

（湛江師范學院生命科學與技術學院，廣東湛江524048）

為提高飼料用芽孢桿菌中性蛋白酶的活力，考察了多種芽孢桿菌混菌發酵產蛋白酶的協同作用效果，并在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析的中心組合試驗設計對多芽孢桿菌的混合發酵工藝條件進行了優化。通過優化確定了混合發酵體系的最佳發酵條件為培養基最初pH值7.17，裝液量50mL/250mL，接種量3%，發酵溫度35.4℃，搖床轉速200r/min，發酵周期100h。在優化的工藝條件下，芽孢桿菌混合發酵產蛋白酶的活力單位可達到2 986U/mL。

芽孢桿菌；混合發酵；蛋白酶；中心組合設計

已有大量研究顯示，大多數芽孢桿菌屬微生物由于能夠分泌胞外淀粉酶和蛋白酶等消化酶，從而可以促進飼料消化，提高飼料利用率[1-2]；芽孢桿菌屬微生物可以在動物腸道定植，從而保持了動物腸道微生態的平衡，有效地抵御外來致病菌的致病作用，可以有效提高動物的抗病能力[3-4]。因此，近年來以枯草芽孢桿菌為代表的芽孢桿菌活菌制劑在養殖業中得到了越來越廣泛的應用[5-6]。

隨著各類芽孢在養殖業中不斷被推廣應用，以芽孢桿菌為代表的活菌制劑的生產規模不斷擴大，芽孢桿菌類活菌制劑的清潔生產及活菌制劑發酵廢液中活性物質，如蛋白酶[7-9]的綜合利用已成為研究重點之一。然而，要實現活菌制劑發酵廢液中蛋白酶的綜合利用，提高發酵廢液中蛋白酶濃度就尤為重要。大量的研究表明，不同芽孢桿菌之間可以存在良好的互惠共生關系[10]，這種有益的共生關系可顯著提高混合系統中各菌株的生長速率及代謝效率，從而在一定程度上提高某些產物的產量[11-13]。依據已有實驗研究報道，本研究擬建立多種不同飼料用芽孢桿菌混合發酵體系，借助芽孢桿菌之間存在的良好共生關系，促進芽孢桿菌的生長，同時提高芽孢桿菌活菌制劑發酵廢液中蛋白酶的活力單位，提升活菌制劑發酵廢液的綜合利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芽孢桿菌（Bacillus）A2、B2、B3菌株：湛江師范學院生命科學與技術學院發酵工程實驗室分離保藏菌種。

斜面培養基：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL，瓊脂15g，pH 7.0～7.2。

種子培養基：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL，pH 7.0～7.2。

發酵培養基：蔗糖40g，蛋白胨20g，K2HPO43g，麩皮30g，吐溫80 1mL，CaCO33g，水1 000mL，pH 7.5。

氫氧化鈉、碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、鎢酸鈉、濃鹽酸等均為分析純：天津市科密歐化學試劑有限公司；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）：上海陽光試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HYQ-60空氣恒溫振蕩器：武漢匯誠生物科技有限公司；SPX-250B-2生化培養箱：上海博訊實業有限公司；723N可見分光光度計、FC104電子天平：上海精密科學儀器有限公司；3-18k冷凍離心機：美國Sigma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的活化

將低溫保存的芽孢桿菌A2、B1、B3菌株分別接種于斜面培養基，將其置于37℃的生化培養箱培養24h。

1.3.2 種子液的培養

在250mL三角瓶中裝入種子培養基50mL，分別從試管斜面上挑取1環活化菌種，然后將其置于恒溫搖床中37℃、150r/min培養24h。

1.3.3 發酵試驗

將培養好的A2、B2、B3液體種子按照體積比2∶3∶3進行混合得到種子混合液。在250mL三角瓶中裝入發酵培養基50mL，滅菌之后按照4%（v/v）的比例接種混合液體種子，然后將三角瓶置于恒溫搖床中37℃、150r/min發酵72h。

1.3.4 粗酶液的分離與蛋白酶活性測定

將發酵72h后的培養液在4℃，8 000r/min的條件下離心10min，然后收集離心所得上清液，即為粗酶液，采用Folin-酚法測定其蛋白酶活性[14]。酶活定義：在試驗條件下，每分鐘水解酪蛋白釋放出1μg當量酪氨酸所需酶量為1個酶活力單位。

1.3.5 發酵條件的單因素試驗

培養基初始pH值對混合發酵產蛋白酶的影響：配制發酵培養基，分別調節其pH值至6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，按照1.3.3的條件進行發酵試驗并測定酶活，考察初始pH值對發酵產酶的影響。

發酵溫度對混合發酵產酶的影響：配制發酵培養基，按照1.3.3的操作分別于27℃、32℃、37℃、42℃和47℃的溫度下進行發酵試驗并測定蛋白酶活力，考察溫度對發酵產酶的影響。

接種量對混合發酵產酶的影響：配制發酵培養基，分別以1%、2%、3%、4%、5%和6%的接種量接種，按照1.3.3的操作進行發酵試驗并測定蛋白酶活力，考察接種量對發酵產酶的影響。

搖床轉速對混合發酵產酶的影響：配制發酵培養基，按照1.3.3的操作分別于50r/min、100r/min、150r/min、200r/min、250r/min的搖床轉速條件下進行發酵試驗并測定蛋白酶活力，考察搖床轉速對發酵產酶的影響。

裝液量對混合發酵產酶的影響：配制發酵培養基，在250mL三角瓶中分別裝發酵培養基25mL、50mL、75mL、100mL和150mL，按照1.3.3的操作進行發酵試驗并測定蛋白酶活力，考察裝液量對發酵產酶的影響。

發酵時間對混合發酵產酶的影響：配制發酵培養基，按照1.3.3的操作進行發酵試驗，分別發酵24h、48h、72h、96h、120h、144h后測定蛋白酶活力，考察發酵時間對發酵產酶的影響。

1.3.6 響應面分析

利用SAS統計軟件，采用響應面分析法的中心組合試驗設計[15]，進一步考察單因素試驗篩選出的顯著影響因素，優化各因素的最佳取值，由此確定混合發酵的工藝條件。

2 結果與分析

2.1 培養基pH值對發酵產酶的影響

分別于不同pH條件下進行發酵試驗考慮了培養基初始pH值對發酵產酶的影響，結果如圖1所示。

圖1 培養基初始pH對混合發酵產酶的影響Fig.1 Effect of initial pH on the protease yield by mixture-culture fermentation

由圖1可知，培養基的起始pH對混合發酵產酶有較顯著的影響，不同pH條件下的發酵產酶單位有明顯差異；發酵培養基的起始pH值設定在7.5左右較為合適。

2.2 發酵溫度對發酵產中性蛋白酶的影響

分別于不同的溫度條件下進行發酵試驗考察溫度發酵產酶的影響，結果如圖2所示。

圖2 溫度對混合發酵產酶的影響Fig.2 Effect of temperature on the protease yield by mixture-culture fermentation

由圖2可知，發酵溫度對混合發酵產酶有顯著的影響；發酵溫度過低（低于27℃）菌體生長非常緩慢進而影響酶的產量；發酵溫度過高（超過40℃）易導致菌體過早衰老死亡，同時也會導致酶的穩定性降低而失活；由試驗結果可初步確定混合發酵的適宜溫度在37℃左右。

2.3 接種量對發酵產酶的影響

分別以不同的接種量進行發酵試驗，考察了接種量對發酵產酶的影響，結果如圖3所示。

圖3 接種量對混合發酵產酶的影響Fig.3 Effect of inoculum on the protease yield by mixture-culture fermentation

由圖3可知，接種量對混合發酵產酶也有一定的影響，過高或過低的接種量均會在一定程度上導致產酶量有所降低；混合發酵的適宜接種量在3%左右。

2.4 轉速與裝液量對發酵產酶的影響

圖4 裝液量(A)及搖床轉速(B)對混合發酵產酶的影響Fig.4 Effect of broth content(A)and rotate speed(B)on the protease yield by mixture-culture fermentation

在搖瓶發酵的條件下，分別從250mL搖瓶裝液量及搖床轉速的角度考察了溶氧量對混合發酵產酶的影響，結果如圖4所示。

由圖4可知，芽孢桿菌混合發酵產酶量的高低受溶氧水平的顯著影響。當搖瓶裝液量過高（＞50mL/250mL）或搖床轉速過低（＜150r/min），則蛋白酶的發酵產量會明顯的降低。因此，要保證芽孢桿菌混合發酵產酶量的最大化，充足的氧氣供應尤為重要。在搖床發酵條件下，最大裝液量為50mL/250mL，搖床轉速不宜低于200r/min。

2.5 發酵時間對發酵產酶的影響

考察了不同發酵周期芽孢桿菌混合發酵產蛋白酶的情況，結果如圖5所示。

圖5 發酵時間對混合發酵產酶的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the protease yield by mixture-culture fermentation

由圖5可知，芽孢桿菌在接種發酵24h后進入快速產酶期，蛋白酶的產率幾乎與發酵時間成線性關系增長；與單一芽孢桿菌發酵產蛋白酶的情況相比[16-17]，在混合發酵系統中芽孢桿菌發酵產酶的周期明顯有所延長，可持續相對更長的發酵產酶時間，這應該是蛋白酶發酵產量得以提高的原因之一；發酵持續到96h后蛋白酶的產量趨于平穩，由此初步確定芽孢桿菌混合發酵的適宜時間為96h。

2.6 中心組合試驗設計

通過以上單因素試驗初步考察了各工藝參數對混合發酵產酶的影響情況，并在此基礎上篩選出了對發酵產酶有顯著影響并易于工藝放大的3個因素（培養基初始pH值、發酵時間和發酵溫度）進行后續的響應面優化，同時固定其他因素取值：搖床轉速為200r/min，接種量為3%，搖瓶裝液量為50mL/250mL。表1、表2分別給出了中心組合設計的因素水平及試驗設計與結果。

表1 中心組合設計因素與水平Table 1 Factors and levels of central composite design

表2 中心組合試驗設計及結果Table 2 Design and results of central composite design

對表2的試驗結果進行回歸分析，可以擬合得到以下數學模型：

從表3可以看出，模型的P＜0.05，表明該模型較顯著；在因素水平的取值范圍內，因素A、B、C的二次項對發酵結果的影響較顯著，而單一因素項A、B、C及因素間的交互作用對發酵產酶的影響不顯著。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

圖6給出了擬合模型的響應曲面。由圖6可以看出，該曲面是典型的凸面響應，其上存在最大響應點。利用SAS軟件分析確定了最大響應值為（2 909±177）U/mL，其對應的因素取值分別為發酵溫度35.4℃，培養基初始pH值為7.17，發酵時間100h。4次重復試驗結果為3 060U/mL、2 954U/mL、2 820U/mL、3 108U/mL，平均值為2 986U/mL，與模型的預測值基本一致，進一步驗證了該模型的可靠性。

圖6 各因素相互作用對混合發酵產酶影響的響應曲面及等高線Fig.6 Response surface plot and contour line of interaction among fermentation time,temperature,pH on the protease yield by mixture-culture fermentation

根據以上優化試驗的結果，由此可確定芽孢桿菌混合發酵產蛋白酶的工藝條件：培養基初始pH值為7.17，裝液量50mL/250mL，接種量3%，于35.4℃，搖床轉速200r/min發酵100h。在此最佳條件下，芽孢桿菌混合發酵產蛋白酶的活力可達到2 986U/mL。

3 結論

本研究擬通過多種芽孢桿菌混合發酵的方式提高芽孢桿菌活菌制劑發酵廢液中蛋白酶的活力單位，從而提高發酵廢液的可利用性，實現活菌制劑發酵廢液的綜合利用及清潔生產。在構建了芽孢桿菌混合配伍體系的基礎上，考察了發酵工藝條件，包括培養基pH值、發酵溫度、時間、接種量、裝液量及搖床轉速對混合發酵產蛋白酶的影響，應用響應面分析的試驗方法對工藝條件進行了優化，最終確立了適宜的芽孢桿菌混合發酵工藝條件：即培養基初始pH7.17，裝液量50mL/250mL，接種量3%，于35.4℃，搖床轉速200r/min發酵100h。在此最佳條件下，芽孢桿菌混合發酵產蛋白酶的活力可達到2 986U/mL。

構建的混合發酵體系使得發酵液中蛋白酶的活力有了顯著的提高，遠高于單一芽孢桿菌的蛋白酶酶活。試驗結果表明，采用混合發酵的方式確實可顯著提高活菌制劑發酵廢液中蛋白酶的活力單位，在一定程度上提高了活菌制劑發酵廢液的綜合利用價值。

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Optimization of fermentation process by mixedBacillusstrains

HE Huamei,LI Shuzhen,CHEN Danxia,PAN Jinquan*
(School of Life Science and Technology,Zhanjiang Normal University,Zhanjiang 524048,China)

To increase the neutral protease activity fermented byBacillusstrains，the synergistic effect of multiple kinds ofBacillusstrains for preparing neutral protease by mixture-culture fermentation was investigated.On the basis of single factor experiment,the fermentation process by mixed Bacillusstrains was optimized through central composite design.After optimization,a proper mixture-culture fermentation process was determined: initial medium pH 7.17,liquid volume 50 ml in 250 ml flask,agitation speed of rotary shaker 200 r/min,inoculum 3%,temperature 35.4℃,fermentation time 100 h.Under these optimized conditions,the active unit of neutral protease produced byBacillusstrains by mixture-culture fermentation reached 2 986 U/ml.

Bacillusstrain;mixture-culture fermentation;protease;central composite design

Q939.97

A

0254-5071（2014）04-0056-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.014

2014-02-28

國家星火計劃項目（2013GA780084）；國家級大學生創新訓練項目（201310579014）

何華美（1989-），女，本科生，研究方向為生物技術。

*通訊作者：潘進權（1978-），男，副教授，博士，研究方向為酶與發酵工程。