魚鱗膠原多肽的制備研究

周 亮，程 威，胡文翠，吳正奇，*

（湖北工業大學輕工學部食品與制藥工程學院，湖北武漢 430068）

魚鱗膠原多肽的制備研究

周 亮1，程 威2，胡文翠3，吳正奇1，*

（湖北工業大學輕工學部食品與制藥工程學院，湖北武漢 430068）

利用單因素實驗優化熱水法提取魚鱗膠原蛋白工藝，使用正交實驗優化膠原多肽酶解工藝。最佳提取工藝為：溫度70℃，時間6h，料液比1∶20，膠原蛋白的得率為32.55%；酶解最佳工藝為：pH9.5，溫度55℃，時間2.0h，酶量0.3%，最大水解度達23.17%；用氨基酸自動分析儀和凝膠滲透色譜法測定膠原多肽氨基酸分布情況和分子質量，結果表明：氨基酸組成符合膠原蛋白特征，膠原多肽分子質量大部分在1000u以內。

魚鱗，膠原蛋白，酶解，膠原多肽，分子質量

魚鱗主要由蛋白質和羥基磷灰石組成，脂肪含量極少（＜1%），蛋白質占魚鱗總質量的50%～70%，其中膠原蛋白（12%～38%）含量豐富，是制備水解膠原多肽的良好原料[1]。膠原多肽源于動物蛋白，其分子結構和植物蛋白相比更適合人體吸收，它不僅具有一般蛋白質的營養作用，還具有不可替代的調節功能和良好的營養特征，人體吸收率達90%以上[2-4]。

傳統膠原蛋白的提取多采用酸堿脫鈣脫脂處理，周期長，步驟繁瑣，對生產設備要求高，成本較高，但得率低[5-7]。本文以草魚鱗為原材料，采用熱水法直接將膠原蛋白從魚鱗中分離出來，然后以高活性的堿性蛋白酶酶解獲取分子質量較小的膠原多肽。魚鱗膠原蛋白在40℃以上變性降解成明膠溶于熱水中[8-9]，能有效地從魚鱗中分離出來，步驟簡單，成本低，得率高，品質好[10]。人體吸收蛋白質主要以多肽的形式，分子量在1000u以下的多肽無需分解可被人體直接吸收；合理利用魚鱗制備膠原多肽不僅可以推動水產加工業的發展，還能夠變廢為寶，減少環境污染，也為解決補膠原蛋白問題開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草魚魚鱗 收集于湖北工業大學南門菜市場；氫氧化鈉、氫氧化鉀、酒石酸鉀鈉、鹽酸、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；堿性蛋白酶 諾維信（中國）生物技術有限公司。

UV-2000型紫外可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；SXJQ-1型數顯直流無級調速攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司，RE52CS型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；GZX-9140MBE型數顯鼓風干燥箱 上海博訊是有限公司醫療設備廠；AR2140型分析天平 美國奧豪斯公司；TDL-50B型離心機 上海安亭科學儀器廠；DELTA 320型pH計 梅特勒儀器有限公司；QSL-08型消化爐、QSY型自動定氮儀 上海愛朗儀器有限公司；氨基酸自動分析儀 上海仁特檢測儀器有限公司；TSKgel2000SWXL型凝膠柱 日本TSK公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚鱗主要成分的測定 原料預處理：將草魚鱗洗干凈，晾干魚鱗表面的水分，部分用于測定含水率，其他的置于鼓風干燥箱烘干，密封保藏。

水分測定：恒溫干燥法（GB/T 5009.3-2010）；灰分測定：高溫灼燒法（GB/5009.4-2010）；總氮含量測定：凱氏定氮法（GB/T 5009.5-2010）；脂肪含量的測定：酸水解法（GB/T 21514-2008）。

1.2.2 膠原蛋白的提取 取相同質量（5g）的干魚鱗進行單因素實驗，將提取的膠原蛋白定容至相同體積，再取一定體積溶液測定吸光度。明膠與雙縮脲試劑反應的吸光度（560nm）與蛋白含量成正比，比較吸光度大小確定最佳提取工藝條件。由于影響條件時間、溫度和料液比相互間的影響極小，獨立性比較強，并且各單因素實驗水平梯度較小，單因素實驗就能夠較確定最佳取值。

1.2.2.1 提取膠原蛋白的工藝優化 影響提膠的主要影響因素有溫度、時間和料液比。通過比較明膠（相同體積）與雙縮脲試劑反應的吸光度大小，確定最佳熬膠條件。

a.取溫度70℃，料液比1∶25，時間的選擇：設計3、4、5、6、7、8h 6個水平，確定最佳提取時間。

b.取時間6h，料液比1∶25，提取溫度的選擇：設計50、60、70、80、90℃ 5個水平，確定最佳提取溫度。

c.取溫度70℃，時間6h，料液比的選擇：設計1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 5個水平，確定最佳提取料液比。

1.2.3 膠原蛋白的酶解工藝優化

1.2.3.1 酶解水解度測定 影響膠原蛋白酶解的因素有底物濃度、溫度、時間、pH、酶添加量，實驗以蛋白質的水解度為指標，通過單因素實驗和正交實驗確定最佳酶解工藝，采用pH-state法[11]測定水解度。取固定濃度為3.2%膠原蛋白液50mL，添加標準氫氧化鈉溶液（0.5mol/L），用于保持水解液中的pH穩定，記錄下消耗堿液的體積，代入公式即可求得水解度。

水解度的公式為：

式中：DH—水解度；Nb—NaOH的摩爾濃度（mol/L）；B—消耗堿量（mL）；MP—底物蛋白的質量（g）；htot—每克蛋白質底物具有的肽鍵毫摩爾數，膠原蛋白取8.41；α—α-氨基的平均解離度。

平均解離度公式為：

式中，pH—水解液的酸堿度；pK—-NH3解離常數。

1.2.3.2 水解度單因素實驗 a.取時間2.0h，pH9.5，酶添加量0.3%，設計40、45、50、55、60、65、70℃7個水平，確定酶解溫度對水解度影響的變化趨勢。

b.取溫度55℃，pH9.5，酶添加量0.3%，設計0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h 5個水平，確定酶解溫度對水解度影響的變化趨勢。

c.取時間2.0h，溫度55℃，酶添加量0.3%，設計pH8.5、9.0、9.5、10、10.5 5個水平，確定酶解pH對水解度影響的變化趨勢。

d.取 時 間 2.0h，溫 度 55℃ ，pH9.5，設 計 0.1% 、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%5個水平，確定酶添加量對水解度影響的變化趨勢。

1.2.3.3 正交實驗 取酶解溫度、時間、pH、酶（質量濃度20%堿性蛋白酶溶液）添加量為主要參考因素，以水解度為指標，采用正交表L9（34）進行4因素、3水平正交實驗，實驗因素水平見表1。

表1 L9（34）正交實驗因素水平Table 1 L9（34）Factors and levels of orthogonal design

1.2.4 膠原多肽分子質量分布及氨基酸組成測定 以最佳工藝條件制備魚鱗膠原多肽，分別采用氨基酸自動分析儀（湖北省農科院農檢所）和凝膠滲透色譜法（湖北工業大學魔技術研究所）測定氨基酸組成及分子質量分布。

采用陽離子交換色譜分離、茚三酮柱后衍生法，對蛋白質水解氨基酸的組分含量進行分析，測定在pH5～5.5、100℃下進行，反應時間為10～15min，利用比色法將生成的紫色物質在570nm波長下測定。

色譜柱：TSK gel G2000SWXL（7.8mm×cm，Tosoh）；流動相：乙腈/水/三氯乙酸（10∶90∶0.1，V/V/V）；柱溫；39℃ ；檢 測 波 長 ：220nm；流 速 ：0.8mL/min；進 樣 量 ：20μL。

1.2.5 數據處理 檢測結果經檢測方處理后再整理。做一個氨基酸全分析一般只需1h左右，同時可將幾十個樣品一起裝入儀器，自動按序分析，最后自動計算給出精確的數據，取三組平行實驗結果的平均值。膠原多肽的分子質量具有多分散性，其分子質量具有統計平均的意義，根據測定結果計算不同區域分子質量的膠原多肽平均百分含量。

2 結果與分析

2.1 草魚鱗基本化學組成

新鮮草魚鱗的含水量約為20.25%。干草魚鱗的主要成分見表2，可知草魚鱗中含有豐富的粗蛋白，粗蛋白含量占干物質約66.06%，灰分約占干物質約31.79%，而脂肪含量＜1%，其他雜質含量極小。灰分在中性環境中難容，加熱條件下，角蛋白不溶于水，而膠原蛋白會降解成明膠而溶于熱水中，其他雜蛋白因加熱變性沉淀出，通過熱水法制備膠原蛋白簡單、方便、節約成本，還可以提高蛋白的純度。

表2 草魚鱗的基本化學組成Table 2 Basic chemical composition of grass fish scales

2.2 膠原蛋白的提取

熱水法提取膠原蛋白的影響因素主要有料液比、pH、溫度和時間，由于此法以軟水為介質，不添加酸和堿，故pH對實驗的影響不考慮。熱水法提取膠原蛋白在節約時間及成本的情況下，得率也較高，測定吸光度曲線可以定性地反映蛋白濃度變化趨勢，可快速、有效地比較各單因素實驗的提取效果。

2.2.1 時間對提膠的影響 由圖1可知，溫度和料液比一定時，隨著提取時間的延長，可溶性膠原蛋白量越來越多，當時間超過6h繼續延長熬膠時間，膠原蛋白質量的增加并不明顯，可能魚鱗中絕大部分膠原蛋白已經溶出，少量與羥基磷灰石結合緊密的膠原蛋白難以溶出，隨時間的延長，溶液的水分蒸發，溶液中膠原蛋白達到平衡狀態，魚鱗中膠原蛋白不再繼續溶出。

圖1 時間對膠原蛋白提取率的影響Fig.1 The effect of time on the extraction rate of collagen

2.2.2 溫度對提膠的影響 由圖2可知，時間和料液比一定時，隨著溫度的升高，可溶性膠原蛋白越來越多，溫度到70℃左右時，膠原最多，隨著溫度繼續升高，膠原蛋白質量逐漸降低，一方面可能高溫條件下，溶液中的水分蒸發較快，導致溶液中膠原蛋白濃度增大，促使了溶質快速達到平衡狀態，從而影響了膠原蛋白濃度溶出，另一方面長時間高溫條件，導致一部分蛋白質降解成分子質量小的物質隨水蒸氣揮發掉。

2.2.3 料液比對提膠的影響 由圖3可知，溫度和時間一定時，可溶性膠原蛋白隨料液比增大而先增后降，料液比為1∶20時，膠原蛋白的溶出量達到最大。料液比太小，水添加量少，干魚鱗難以溶脹，膠原蛋白不易擺脫羥基磷灰石的束縛，并且溶液中膠原蛋白濃度容易很快達到飽和狀態，加上攪拌不均勻，不利于膠原蛋白的溶出。

圖2 溫度對膠原蛋白提取率的影響Fig.2 The effect of temperature on the extraction rate of collagen

圖3 料液比對提取率的影響Fig.3 The effect of material to liquid ratio on the extraction rate of collagen

取3份一定量的干燥魚鱗在最佳提取條件時間6h、溫度70℃和料液比1∶20的條件下制備蛋白，其平均提取率可達到32.55%，在魚鱗含12%～38%膠原蛋白的范圍內。

2.3 膠原蛋白的水解

2.3.1 單因素實驗 在膠原蛋白濃度固定的情況下，影響膠原蛋白酶解的主要因素為溫度、時間、pH、酶添加量。

2.3.1.1 時間對水解度的影響 由圖4可知，溫度、pH和酶添加量不變時，膠原蛋白水解度隨著時間的增加而升高，當時間超過1.5h后，水解度保持平緩，可能隨著酶解的進行，底物濃度降低，并且長時間的酶解使蛋白酶的酶活性下降，導致酶解速率下降，也可判斷膠原蛋白基本酶解完全，延長酶解時間，不僅消耗更大，還會使膠原蛋白酶解成分子質量更小的氨基酸，影響膠原多肽的品質。

圖4 時間對水解度的影響Fig.4 The effect of time on the extraction rate of collagen

2.3.1.2 溫度對水解度的影響 由圖5可知，時間、pH和酶添加量不變時，膠原蛋白的水解度在50～55℃較高，可知在此溫度范圍內，堿性蛋白酶的活性最大，膠原蛋白的酶解速率最快，而溫度低，酶的活性受抑制，溫度太高，酶易失活，均會降低酶解速率。

圖5 溫度對水解度的影響Fig.5 The effect of temperature on the extraction rate of collagen

2.3.1.3 pH對水解度的影響 由圖6可知，溫度、時間和酶添加量不變時，膠原蛋白的水解度在pH9.5左右最大，說明在此pH條件下，堿性蛋白酶的活性最大，酶解效果最好，而pH太低或太高，酶的活性受抑制，均會降低酶解速率。

圖6 pH對水解度的影響Fig.6 The effect of pH on the extraction rate of collagen

2.3.1.4 酶量對水解度的影響 由圖7可知，在溫度、時間和pH不變時，膠原蛋白的水解度隨著酶添加量增大先升高后平穩，說明酶添加量在0.2%～0.3%范圍內已經達到飽和，再增加酶量也不能提高膠原蛋白的水解度，即在酶量達到飽和狀態下對酶解最適宜。2.3.2 正交實驗 由正交實驗數據處理結果（表3）可知，影響膠原蛋白水解的因素主次順序為：A＞D＞ B＞C，即時間和酶添加量對膠原蛋白酶解的影響比較大，而溫度和pH影響相對較小，最佳酶解條件組合為：A3B3C2D3，即時間2.0h，溫度55℃，pH9.5，酶添加量0.3%，驗證實驗表明此條件下的最大水解度達23.17%，比正交實驗中的最優組合所得結果（21.21%）大。

圖7 酶添加量對水解度的影響Fig.7 The effect of temperature on the extraction rate of collagen

表3 正交實驗結果Table 3 The test data of orthogonal of four factors in three-level list

表4 正交實驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal results

由于因素C（pH）的極差為0.6，很小，故可將它的方差分析忽略不計，故可做如表4的正交實驗結果方差分析。由方差分析結果看出，在本實驗中A、D因素的水平變化對實驗結果影響非常顯著（p＜0.05），其中A比D顯著，而B、C因素的水平變化對實驗影響不顯著（p＞0.05），即時間和酶添加量對酶解的影響顯著，而溫度和pH影響不顯著，與正交實驗結果分析一致。

2.4 膠原多肽氨基酸組分及平均分子質量

2.4.1 氨基酸的分布情況 通過氨基酸自動分析儀進行檢測，由表5可知，膠原多肽中甘氨酸含量為22.5496%，羥脯氨酸含量為10.1265%，脯氨酸含量氨基酸含量12.9158%，色氨酸未檢測出，氨基酸組成符合膠原蛋白的特征。

表5 膠原多肽氨基酸的分布Table 5 The composition of the amino acids

2.4.2 分子質量的分布情況 魚鱗水解膠原多肽分子質量分布見表6，堿性蛋白酶水解的魚鱗膠原蛋白的分子質量在1638～451.5u的多肽占11.66%，分子質量451.5u的多肽占69.76%，分子質量451.5～189.7u的多肽占18.42%，即大部分水解膠原多肽的分子質量在1000u以內，適合人體的吸收。

表6 分子質量分布Table 6 Distribution of molecular mass of collagen peptide

3 結論

熱水法提取膠原蛋白是提取魚鱗膠原蛋白的綠色方法，在時間6h、溫度70℃和料液比1∶20的最佳提取工藝條件下，魚鱗膠原蛋白的得率達到32.55%，能夠提取出魚鱗中大部分膠原蛋白，并且實驗中雙縮脲法快速簡單，定性準確，有效減少了實驗量。但是實驗中由于草魚鱗韌性較大，不易粉碎，一定程度上增加了提取時間和降低了提取率。

在時間2.0h、溫度55℃、pH9.5、酶添加量0.3%的最佳酶解條件下，膠原多肽的水解度達到23.17%，制備的膠原多肽的氨基酸分布符合理論要求，并且膠原多肽的分子質量較小，適合人體的吸收利用。

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Study on extracting collagen polypeptide from fish scale

ZHOU Liang1，CHENG Wei2，HU Wen-cui3，WU Zheng-qi1，*
（Food and Pharmaceutical Engineering Institute，Light Industry Department，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

Using single factor experiments to optimize technology that hot water was used to extract collagen from fish scale.Then，using orthogonal experiments to optimize the enzymolysis technology of collagen peptide that were studied.When extraction temperature of solution was 70℃ ，extraction time was 6 hours and ratio of material to solvent was 1 ∶20，the optimum extraction process was obtained，and the maximum yield was 32.55%.When the pH of solution was 9.5，the temperature of solution was 55℃，the reaction time was 2.0 hours and amount of enzyme was 0.3% （v/v） ，the optimum extraction process of collagen enzyme was obtained，and the largest degree of hydrolysis was 23.17%.Automatic amino acid analyzer was used to measure amino acids of collagen polypeptide distribution，its amino acid composition was according with the characteristic of collagen.Gel permeation chromatography was used to determine the molecular mass of collagen peptide ，most of the molecular mass of collagen peptide was within 1000u.

fish scale；collagen；enzymatic hydrolysis；collagen polypeptide；molecular mass

TS254.9

B

1002-0306（2014）20-0327-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.063

2014-01-16

周亮（1987-），男，碩士研究生，研究方向：農產品加工。

* 通訊作者：吳正奇（1966-），男，教授，研究方向：蛋白質資源利用和食品加工新技術與新工藝。