不同營養(yǎng)元素對小球藻Chlorella sorokiniana C74生長的影響

張 玲，楊 勛，張 森，羅 寧，劉平懷

（海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海南海口 570228）

不同營養(yǎng)元素對小球藻Chlorella sorokiniana C74生長的影響

張 玲，楊 勛，張 森，羅 寧，劉平懷*

（海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海南海口 570228）

以小球藻（Chlorella sorokiniana）為研究對象，考察了不同的培養(yǎng)基，不同的氮源，氮濃度和磷濃度對其細(xì)胞生長及營養(yǎng)成分的影響。結(jié)果表明，小球藻細(xì)胞生長最佳培養(yǎng)基為BBM培養(yǎng)基。不同培養(yǎng)基對其油脂、蛋白質(zhì)和色素含量影響較小，BG-11培養(yǎng)基下多糖含量（44.46%）明顯高于其他培養(yǎng)基。以甘氨酸為氮源時小球藻的生物量、油脂、蛋白質(zhì)、多糖和色素含量均高于其他組。小球藻細(xì)胞生長最佳氮濃度為13.33mmol/L，缺氮情況下生物量、油脂、蛋白質(zhì)和色素含量較低，但多糖含量較高，約為其他組的2倍。小球藻細(xì)胞生長最佳磷濃度為1.72mmol/L。隨著磷濃度升高，小球藻生物量、油脂和蛋白質(zhì)含量先增大后降低，多糖和色素含量隨磷濃度升高略有降低。

小球藻，細(xì)胞生長，培養(yǎng)基，氮源，磷

微藻是一類分布廣泛，光合效率高的自養(yǎng)低等生物，是地球上最古老的初級生產(chǎn)者之一。微藻在其生長繁殖過程中產(chǎn)生及其豐富的代謝產(chǎn)物，其中以脂類、蛋白質(zhì)、糖類和色素居多，這些物質(zhì)在能源、食品、餌料和醫(yī)藥方面有著重要的應(yīng)用。微藻的生長及其代謝產(chǎn)物與其培養(yǎng)條件息息相關(guān)。氮源是限制微藻生長和代謝的重要因素之一，氮是合成氨基酸所必需的元素。研究表明，氮源對微藻生長、油脂積累和蛋白質(zhì)含量均有較大影響，氮的缺乏會導(dǎo)致微藻細(xì)胞生長受到抑制，但有利于油脂積累[1-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，Neochloris oleoabundans[7]、眼點擬微球藻[8]在以硝酸鈉為氮源時生長最快，生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)率最高。磷是構(gòu)成微藻細(xì)胞膜、核酸的重要元素，是多種酶的輔基，參與碳水化合物的代謝及脂肪酸的轉(zhuǎn)化，并且是合成葉綠素所必須的。磷是水生生態(tài)系統(tǒng)初級生產(chǎn)力水平的關(guān)鍵制約因素，培養(yǎng)液中磷濃度水平對微藻生長及代謝產(chǎn)物會造成一定的影響。Ruangsomboom S[9]的 研 究 表 明 ，不 同 磷 濃 度 對 于Botryocococcus braunii的生長影響不明顯，但磷濃度過高或過低都對油脂積累不利。

改變培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分會導(dǎo)致微藻細(xì)胞代謝產(chǎn)物類型及比例發(fā)生改變，本研究以小球藻為研究對象，考察不同培養(yǎng)基、氮源及氮濃度和磷濃度對藻細(xì)胞的生長及代謝產(chǎn)物的影響，以期為培養(yǎng)小球藻獲得特定類型代謝產(chǎn)物提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小 球 藻（Chlorella sorokiniana C74） 分 離 自 海南儋州，現(xiàn)保存于海南大學(xué)生物工程實驗室；蒽酮、硫酸、葡萄糖、甲醇、氯仿、丙酮、硝酸鈉、硝酸銨、氯化銨、尿素、磷酸等 均為國產(chǎn)分析純；甘氨酸 為食品級。

CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī) 日立；LGJ-25C冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)儀器；TU-1810紫外可見分光光度計 普析通用。

1.2 培養(yǎng)條件

采用柱形光生物反應(yīng)器培養(yǎng)小球藻，裝新鮮培養(yǎng)液滅菌冷卻后按10%（V/V）接種，全天光照，光照強(qiáng)度為8000lux，培養(yǎng)溫度為26℃，通入無菌空氣，通氣量為5L/min。培養(yǎng)結(jié)束后離心收集藻液，凍干后藻粉保存于-20℃冰箱。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 不同培養(yǎng)基對小球藻細(xì)胞生長及細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)成分的影響 小球藻在五種培養(yǎng)基（AF-6、BBM、TAP、SE和BG-11）下培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為15d，培養(yǎng)過程中每天取樣一次，測定680nm處的光密度（OD680），培養(yǎng)結(jié)束后8000r/min離心5min收集藻泥，凍干后測定生物量和藻細(xì)胞內(nèi)油脂、蛋白質(zhì)、多糖和色素含量。

1.3.2 不同氮源對小球藻細(xì)胞生長及細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)成分的影響 選取上述實驗中藻細(xì)胞生長最適的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以硝酸鈉、硝酸銨、尿素、氯化銨和甘氨酸為氮源，最終有效氮濃度均為8.82mmol/L，培養(yǎng)周期為10d，培養(yǎng)過程中每天取樣一次，測定680nm 處 的 光 密 度（OD680），培 養(yǎng) 結(jié) 束 后 8000r/min 離心5min收集藻泥，凍干后測定生物量和藻細(xì)胞內(nèi)油脂、蛋白質(zhì)、多糖和色素含量。

1.3.3 氮濃度對小球藻細(xì)胞生長及細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)成分的影響 在上述實驗基礎(chǔ)上，以藻細(xì)胞生長最佳氮源為基礎(chǔ)氮源，設(shè)定氮濃度為0、13.33、26.67、40mmol/L，培養(yǎng)周期為10d，培養(yǎng)過程中每天取樣一次，測定680nm 處 的 光 密 度（OD680），培 養(yǎng) 結(jié) 束 后 8000r/min 離心5min收集藻泥，凍干后測定生物量和藻細(xì)胞內(nèi)油脂、蛋白質(zhì)、多糖和色素含量。

1.3.4 磷濃度對小球藻細(xì)胞生長及細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)成分的影響 在上述實驗基礎(chǔ)上，設(shè)定磷（原BBM培養(yǎng)基中的磷源，磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀）濃度為0.43、0.86、1.72、3.44、5.16mmol/L，培養(yǎng)周期為10d，培養(yǎng)過程中每天取樣一次，測定680nm處的光密度（OD680），培 養(yǎng) 結(jié) 束 后8000r/min 離 心5min收 集 藻 泥 ，凍 干 后測定生物量和藻細(xì)胞內(nèi)油脂、蛋白質(zhì)、多糖和色素含量。

1.4 分析方法

1.4.1 生長曲線及生物量 微藻培養(yǎng)過程中每天測定OD680值，根據(jù)光密度值繪制微藻生長曲線。藻液培養(yǎng)完成后離心，離心（8000r/min）5min收集微藻，藻泥使用冷凍干燥機(jī)干燥，干燥后按照式（1）計算生物量：

1.4.2 油脂含量測定 參照Luyen HQ[10]油脂測定方法，稱取藻粉0.1g，加入氯仿-甲醇-水（體積比為1∶2∶0.8）混合液20mL，50℃超聲提取15min，然后加入氯仿-水（體積比為1∶1）混合液10mL，50℃超聲提取15min，靜置分層，取有機(jī)相于50℃下干燥至恒重，計算出油率，設(shè)3個平行實驗，取平均值。按照式（2）計算油脂含量：

式中，m1表示0.1g藻粉提取所得到的油脂含量，單位為g。

1.4.3 蛋白質(zhì)含量測定 采用雙縮脲法測定藻體內(nèi)蛋白質(zhì)含量，得到蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線：

C（mg/mL）=19.23OD540+0.05（R2=0.999）

蛋白質(zhì)提取液制備[11]：取0.1g藻粉，加入4mL PBS緩 沖 液 ，凍 融 破 碎 3 次（每 次 30min），超 聲 15min，4000r/min離心10min，取上清液，藻泥重復(fù)提取一次，合并上清液，定容至10mL。

取1mL待測液加入4mL雙縮脲試劑，于540nm處比色。以1mL蒸餾水加入4mL雙縮脲試劑作參比。設(shè)3個平行實驗，取平均值。根據(jù)繪制的蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量。

1.4.4 多糖含量測定 采用硫酸-蒽酮比色法測定藻 體 內(nèi) 多 糖 含 量[11]，得 到 葡 萄 糖 含 量 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 ：C（mg/mL）=1.11×OD620-0.012（R2=0.993）。

多 糖 提 取 液 制 備 參 照 王 俊[12]的 方 法 并 加 以 改進(jìn)：取藻粉0.1g，加蒸餾水3mL，超聲10min后研磨數(shù)次，藻液轉(zhuǎn)入燒杯中，用6mL蒸餾水清洗研缽，合并清洗液，加入6mol/L鹽酸6mL，攪拌均勻后沸水浴30min，調(diào)pH=7，過濾，濾液定容至500mL。

取1mL待測液加入4mL蒽酮試劑，沸水浴中煮沸10min，自來水冷卻至室溫，于620nm處比色。以1mL蒸餾水加4mL蒽酮試劑作參比。設(shè)3個平行實驗，取平均值。根據(jù)繪制的葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算藻細(xì)胞內(nèi)多糖含量。

1.4.5 色素含量測定 取藻粉20mg，加入5mL 80%丙酮，避光過夜放置，4000r/min離心10min，取上清液，定容至100mL。取上述提取液于470、663、645nm處測定吸光度值[13]，以80%丙酮為空白對照。按如下公式計算色素含量：

藻細(xì)胞色素含量（%）=CT×V/m2×100

式中，Ca、Cb、Cx+c、CT分別為葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總色素質(zhì)量濃度（μg/mL）；V為提取液體積（100mL）；m2為藻粉質(zhì)量（20mg）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0單因素方差分析（ANOVA）中的Duncan兩兩比較對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差及差異顯著性分析。使用Microsoft Office Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對小球藻細(xì)胞生長及細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)成分的影響

如圖1所示，小球藻在TAP培養(yǎng)基中生長最快，培養(yǎng)4d后即進(jìn)入穩(wěn)定期，其OD680值最大；其次為BBM、SE、BG-11和AF-6培養(yǎng)基。采用5種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻，其最終生物量、油脂含量、蛋白質(zhì)含量、多糖含量和色素含量見表1。由表1可知，采用TAP和BBM培養(yǎng)基培養(yǎng)生物量無顯著性差異（p＞0.05），略高于SE和BG-11培養(yǎng)基，AF-6培養(yǎng)基生物量最低。采用5種培養(yǎng)基條件下小球藻油脂含量無明顯差異（p＞0.05）。SE組蛋白質(zhì)含量最高，其次為BBM組，TAP、BG-11和AF-6組蛋白質(zhì)含量基本相同。BG-11組多糖含量明顯高于其他4組（p＜0.05），這可能是因為在BG-11培養(yǎng)基中存在著含量較高的Na2CO3使得微藻在生長過程中大量合成多糖。TAP組色素含量最高，略高于SE、BBM和AF-6組，是BG-11組的2倍。綜合上述，小球藻生物量、油脂、蛋白質(zhì)、多糖和色素積累最佳培養(yǎng)基分別為TAP、SE、SE、BG-11和TAP培養(yǎng)基。由于小球藻在TAP和BBM培養(yǎng)基中生物量基本相同，但TAP培養(yǎng)基中使用較大量的三羥甲基甲胺（2.42g/L），其培養(yǎng)成本明顯高于BBM培養(yǎng)基，因此選擇BBM培養(yǎng)基為小球藻生長最佳培養(yǎng)基。

圖1 不同培養(yǎng)基對小球藻生長的影響Fig.1 Effect of different culture medium on the growth of Chlorella sorokiniana C74

圖2 不同氮源對小球藻生長的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on the growth of Chlorella sorokiniana C74

表1 不同培養(yǎng)基下小球藻細(xì)胞生物量及細(xì)胞主要成分Table 1 Biomass productivities and main ingredients of Chlorella sorokiniana C74 cells in different culture medium

2.2 不同氮源對小球藻細(xì)胞生長及細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)成分的影響

以BBM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，考察五種不同氮源（硝酸鈉、硝酸銨、尿素、氯化銨、甘氨酸）對小球藻細(xì)胞生長及細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)成分的影響，結(jié)果見圖2和表2。小球藻在以甘氨酸為氮源時生長最快，其次為硝酸鈉和尿素；以甘氨酸和尿素為氮源時培養(yǎng)4d即進(jìn)入平穩(wěn)期，但甘氨酸組細(xì)胞密度明顯大于尿素組；以硝酸鈉為氮源時在整個培養(yǎng)周期藻細(xì)胞一直處于增長狀態(tài)；小球藻在以氯化銨和硝酸銨為氮源時生長速度緩慢，在培養(yǎng)4d后微藻藻液變黃，之后藻體結(jié)塊下沉，檢測發(fā)現(xiàn)其pH分別為4.3和5.0，這可能是氨態(tài)氮的消耗導(dǎo)致培養(yǎng)液pH降低，使得小球藻生長受到抑制。小球藻在不同氮源下的生物量與生長速率基本一致，甘氨酸組生物量明顯高于其他組（p＜0.05）。小球藻在以甘氨酸為氮源時油脂含量最高，其他氮源下油脂含量無顯著性差異（p＞0.05）；在不同氮源下小球藻蛋白質(zhì)含量從高到低依次為甘氨酸、硝酸鈉、硝酸銨、尿素和氯化銨；以甘氨酸、硝酸銨、尿素和氯化銨為氮源時色素含量基本相同，而硝酸鈉組略低于其他組。氮元素是影響微藻生長最為關(guān)鍵的營養(yǎng)因子之一，目前關(guān)于氮源對微藻生長影響的相關(guān)研究較多，但結(jié)論不盡相同。張青田等[14]研究發(fā)現(xiàn)硝酸鈉對銅綠微囊藻的生長速率明顯高于氨氮和尿素；Li[7]及劉平懷等[15]研究不同氮源對微藻的影響，結(jié)果表明添加銨態(tài)氮的藻液生長狀況最差，這與本研究中的結(jié)果相同。甘氨酸是一種有機(jī)氮源，含碳量及含氮量分別為32.0%和18.6%，可以作為微藻細(xì)胞生長的碳源及氮源。本研究發(fā)現(xiàn)，小球藻在以甘氨酸為氮源時生長速度最快且各營養(yǎng)成分含量均較其他實驗組高，這與相關(guān)研究報道[16]結(jié)果一致，甘氨酸是最易同化的氨基酸，是某些單細(xì)胞藻類的最好氮源，確定甘氨 酸 為小 球藻 Chlorella sorokiniana C74的 最 佳氮源。

2.3 不同氮濃度對小球藻細(xì)胞生長及細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)成分的影響

以BBM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，考察不同氮源濃度對小球藻細(xì)胞生長及細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)成分的影響，結(jié)果如圖3和表3所示。由圖3可以看出，添加甘氨酸后小球藻的生長速率明顯高于缺氮條件，但過高濃度甘氨酸會對藻細(xì)胞生長有一定抑制。小球藻生物量與細(xì)胞生長情況一致，均隨著甘氨酸濃度升高先升高后略有降低，當(dāng)甘氨酸濃度為13.33mmol/L時生物量最高，達(dá)3.22g/L，為缺氮組的1.53倍。在實驗濃度范圍內(nèi)，甘氨酸對小球藻油脂和蛋白質(zhì)含量均無影響（p＞0.05）。在缺氮情況下藻細(xì)胞多糖含量達(dá)62.36%，是含甘氨酸組的1.7～2.4倍，油脂、蛋白質(zhì)和色素含量均低于含甘氨酸實驗組，這可能是由于在缺氮環(huán)境下，小球藻合成多糖的過程得到促進(jìn)，油脂、蛋白質(zhì)、葉綠素的合成受阻并最終導(dǎo)致細(xì)胞分裂減緩或停止的結(jié)果[17]。綜合上述實驗結(jié)果確定小球藻細(xì)胞最適甘氨酸濃度為13.33mmol/L。

圖3 不同氮濃度對小球藻生長的影響Fig.3 Effect of different concentrations of nitrogen on the growth of Chlorella sorokiniana C74

圖4 不同磷濃度對小球藻生長的影響Fig.4 Effect of different concentrations of phosphorus on the growth of Chlorella sorokiniana C74

表2 不同氮源下小球藻細(xì)胞生物量及細(xì)胞主要成分Table 2 Biomass productivities and main ingredients of Chlorella sorokiniana C74 cells in different nitrogen sources

表3 不同氮濃度下小球藻細(xì)胞生物量及細(xì)胞主要成分Table 3 Biomass productivities and main ingredients of Chlorella sorokiniana C74 cells in different concentrations of nitrogen

表4 不同磷濃度下小球藻細(xì)胞生物量及細(xì)胞主要成分Table 4 Biomass productivities and main ingredients of Chlorella sorokiniana C74 cells in different concentrations of phosphorus

2.4 不同磷濃度對小球藻細(xì)胞生長及細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)成分的影響

磷是微藻生長的必需元素，參與合成ATP、GTP、核酸、磷脂和輔酶等。磷元素是藻類合成葉綠素所必需的，同時參與碳水化合物的代謝及脂肪酸的轉(zhuǎn)化，不同的藻類對磷的濃度有不同的要求。本實驗以BBM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，以13.33mmol/L甘氨酸為氮源，考察不同磷濃度對小球藻生長和細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)成分的影響，結(jié)果見圖4和表4。

由圖4可知，磷濃度對小球藻的生長速率影響不明顯，當(dāng)磷濃度為1.72mmol/L時微藻細(xì)胞生長速率最快，略高于其他濃度。隨著磷濃度的升高，小球藻生物量先升高后降低，在1.72mmol/L時生物量最高，為2.70g/L。不同磷濃度下小球藻細(xì)胞多糖和色素含量無明顯差異（p＞0.05）；油脂和蛋白質(zhì)的含量均隨磷濃度的增加先升高后降低。已有研究表明，低磷濃度能夠促進(jìn)藻細(xì)胞油脂、葉綠素a及微藻囊毒素的積累[3，18-19]。實驗結(jié)果顯示，小球藻細(xì)胞生長最適磷濃度為1.72mmol/L。

3 結(jié)論

本實驗以小球藻為研究對象，研究了不同培養(yǎng)基、氮源、氮濃度及磷濃度對小球藻細(xì)胞生長和細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)成分的影響。實驗結(jié)果表明，不同培養(yǎng)基對小球藻生長有較大的影響。采用TAP和BBM培養(yǎng)基小球藻生物量最高，采用 BG-11培養(yǎng)基藻細(xì)胞多糖含量明顯高于其他培養(yǎng)基。以甘氨酸為氮源小球藻生物量和細(xì)胞內(nèi)油脂、蛋白質(zhì)、多糖、色素含量均為最高。小球藻培養(yǎng)最佳甘氨酸濃度為13.33mmol/L，過高或者過低濃度的甘氨酸均會對藻細(xì)胞生長產(chǎn)生影響，在缺氮情況下油脂和蛋白質(zhì)含量較低，但多糖含量明顯高于其他組。磷濃度對小球藻生長及細(xì)胞內(nèi)油脂、蛋白質(zhì)、多糖和色素含量均無較大影響，隨著磷濃度升高，小球藻生物量、油脂和蛋白質(zhì)含量先增大后降低，多糖和色素含量略有降低，小球藻細(xì)胞生長最適磷濃度為1.72mmol/L。

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Effect of trophic elements on the cell growth of Chlorella sorokiniana C74

ZHANG Ling，YANG Xun，ZHANG Sen，LUO Ning，LIU Ping-huai*
（College of Materials and Chemical Engineering，Hainan University，Haikou 570228，China）

The cell growth and nutritional components in Chlorella sorokiniana under different culture medium，different nitrogen sources，concentration of nitrogen and concentration of phosphorus was investigated.Results showed that the most adequate culture medium was BBM.There was no significant difference to the content of lipid，protein and pigment under different culture medium，the highest content of polysaccharose was 44.46%in the BG-11 medium.The best nitrogen source was glycine，with which the biomass，content of lipid，protein and polysaccharose were higher than other nitrogen sources.The optimum concentration of nitrogen source was 13.33mmol/L.Without any nitrogen sources，the biomass，content of lipid，protein，and pigment were least，but the polysaccharose content was highest，which was 2 folds of other groups.The optimum concentration of phosphorus was 1.72mmol/L.With increasing concentration of phosphorus ， the biomass ， lipid and protein content of Chlorella sorokiniana were increasing at first and then decreasing，and polysaccharides and pigment content were decreasing slightly.

Chlorella sorokiniana；cell growth；culture medium；nitrogen sources；phosphorus

TS201.1

A

1002-0306（2014）20-0208-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.037

2014－01－14

張玲（1989-），女，碩士研究生，主要從事微藻生物活性物質(zhì)方面的研究。

* 通訊作者：劉平懷（1967-），男，教授，主要從事微藻生物質(zhì)資源方面的研究。

國家科技支撐計劃項目課題（2011BAD14B01）；海南省中藥現(xiàn)代化科技專項（ZY201327）；國家科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金（13C26244604892）。