響應面法優化產蝦青素假單胞菌的發酵培養基

劉 艷，馮 印，莫 言，閔偉紅，馬景喜，*

（1.長春科技學院，生物食品學院，吉林長春 130600；2.吉林農業大學食品科學與工程學院，發酵工程實驗室，吉林長春 130118）

響應面法優化產蝦青素假單胞菌的發酵培養基

劉 艷1，馮 印1，莫 言1，閔偉紅2，馬景喜1，*

（1.長春科技學院，生物食品學院，吉林長春 130600；2.吉林農業大學食品科學與工程學院，發酵工程實驗室，吉林長春 130118）

利用響應面法對產蝦青素菌株的培養基進行優化，確定發酵培養基最佳配方。最佳的培養基配方為KH2PO40.4%，MgSO4·7H2O 0.08%，酵母膏0.3%，可溶性淀粉1.2%，在此發酵條件下蝦青素產量最高，為149.4mg/L。同時建立蝦青素產量與KH2PO4、MgSO4·7H2O、酵母膏、可溶性淀粉的添加量之間的二次多項式模型，該模型可以很好地預測蝦青素產量，可獲得最佳的工藝條件。

蝦青素，假單胞菌，培養基優化，響應面

本實驗室在前期研究中，從土壤中篩選出產蝦青素的假單胞菌株并對其進行誘變得到了一株高產蝦青素的假單胞菌株（CTD004），其蝦青素的細胞產率可達到119mg/L。顯示該菌株具有很強的蝦青素生產能力。因此，為了進一步提高CTD004菌株的蝦青素生產能力和產業化利用價值，本研究利用響應面法對產蝦青素假單胞菌的發酵培養基進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CTD004菌株（自命名，經初步鑒定屬于沼澤紅假單胞菌） 吉林農業大學發酵工程實驗室；蝦青素標準樣品 購于Sigma公司；二甲基亞砜、氯仿、甲醇、冰醋酸、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、酵母膏、KH2PO4、MgSO4·7H2O 均為進口分裝或國產分析純。

AUY220型分析天平SHIMADZU PHILIPPINES；Z36HK型高速冷凍離心機 德國HERMLE公司；SHP-250型生化培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；CL-32L型高壓蒸汽滅菌器 日本ALP公司；HZQ-C型空氣恒溫振蕩器 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司。

1.2 培養基

斜面培養基：蛋白胨10g，葡萄糖10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 1g，酵 母 膏2g，瓊 脂20g，定 容 至1L蒸 餾水中，pH7.2～7.5，121℃，滅菌20min。

種子培養基：蛋白胨10g，葡萄糖10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 1g ，酵 母 膏 2g，定 容 至 1L 蒸 餾 水 中 ，pH7.2～7.5，121℃，滅菌20min。

式中:Yk是隨機高度;X和Z分別是射程和方向散布;k是隨機高度編號1～10;rk是-0.05至0.05之間符合均勻分布的10個隨機數(由蒙特卡洛法生成)；n為隨機數的個數。

發酵培養基：蛋白胨10g，可溶性淀粉10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 1g，酵 母 膏2g，定 容 至 1L 蒸 餾 水 中 ，pH7.2～7.5，121℃，滅菌20min。

1.3 實驗方法

1.3.1 培 養 方 法 將 斜 面 保 存 的 菌 種 接 入 裝 有30mL/250mL種子培養基的搖瓶中，160r/min、30℃培養12h進行活化。將活化的菌液裝入50mL/500mL發酵培養基的搖瓶中，160r/min、30℃培養72h，取發酵液測定蝦青素的含量。

1.3.2 發酵培養基的單因素優化

1.3.2.1 可溶性淀粉和酵母膏添加量的確定 選擇可溶性淀粉添加量為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，其他同發酵培養基，單因素實驗選擇最佳的可溶性淀粉添加量；選擇酵母膏添加量為0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%其他同發酵培養基，單因素實驗選擇最佳的酵母膏添加量。

1.3.2.2 MgSO4·7H2O和KH2PO4添加量的確定 選擇MgSO4·7H2O 添 加 量 為 0.05% 、0.1% 、0.15% 、0.2% 、2%、0.25%其他同發酵培養基，單因素實驗選擇最佳的MgSO4·7H2O添加量；選擇KH2PO4添加量為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、2%、0.25%，其他同發酵培養基，單因素實驗選擇最佳的KH2PO4添加量。

1.3.3 蝦青素含量測定 采用分光光度法測定發酵液中蝦青素含量[9]，由于蝦青素是一種細胞內色素，需要混合破壁提取試劑提取。甲醇與氯仿按體積比5∶1配成試劑Ⅰ，冰醋酸與二甲基亞砜按體積比5∶1配成試劑Ⅱ，將試劑Ⅰ與試劑Ⅱ按體積比3∶1配成混合破壁試劑。發酵液經8000r/min離心10min后，用蒸餾水洗兩遍，離心得鮮菌體，攪拌后加入混合破壁試劑，環境溫度為30℃。攪拌，于8000r/min離心10min得提取液，480nm下，以混合破壁試劑作為參比液調零，測定其OD值。將OD值代入蝦青素的標準曲線y= 1.2786x-0.0088（R2=0.9995），即可算出發酵液中蝦青素的含量。

1.3.4 響應面優化 在單因素實驗結果基礎上，采用 Box-Behnken 響 應 面 實 驗 設 計 法[10-15]，以 KH2PO4、MgSO4·7H2O，酵母膏，可溶性淀粉為自變量，分別以X1、X2、X3、X4表示，以蝦青素產量為指標進行優化見表1。

表1 Box-Behnken響應面設計實驗因素及編碼Table 1 Factors and their coded levels in response surface design

1.4 數據統計與分析

采 用Design-Expert軟 件（Version 7.0 Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN，USA）對響應面實驗得到的數據進行線性回歸和方差分析[16-17]，模型及因素的顯著性均通過F值考察（p＜0.05），所有實驗均做3個重復。

2 結果與分析

2.1 培養基的單因素優化

2.1.1 可溶性淀粉添加量對蝦青素產量的影響 由圖1可看出，當可溶性淀粉添加量為0.5%～1%時，蝦青素的含量不斷增加，并達到最大值101.5mg/L，繼續增加可溶性淀粉添加量，蝦青素的含量逐漸降低。因此，確定可溶性淀粉最佳添加量為1%。

圖1 可溶性淀粉對菌種產蝦青素的影響Fig.1 Effect of soluble starch addition amount on astaxanthin production by the strain

2.1.2 酵母膏對菌株產蝦青素的影響 由圖2可看出，當酵母膏添加量為0.25%～1%時，蝦青素的含量不斷增加，并達到最大值109.5mg/L，繼續增加酵母膏的添加量，蝦青素的含量逐漸降低。因此，確定酵母膏最佳添加量為1%。

2.1.3 MgSO4·7H2O 的 添 加 量 對 菌 株 產 蝦 青 素 的 影響 由 圖3可 看 出 ，當MgSO4·7H2O添 加 量 為0.05% ～0.1%時，蝦青素的含量不斷增加，并達到最大值111.7mg/L，繼 續 增 加 MgSO4·7H2O 添 加 量 ，蝦 青 素 的含量逐漸降低。因此，確定MgSO4·7H2O最佳添加量為0.1%。

圖2 酵母膏對菌種產蝦青素的影響Fig.2 Effect yeast powder addition amount on astaxanthin production by the strain

圖3 MgSO4·7H2O的添加量對菌種產蝦青素的影響Fig.3 Effect of MgSO4·7H2O addition amount onastaxanthin production by the strain

2.1.4 KH2PO4的添加量對菌株產蝦青素的影響 由圖4可看出，當KH2PO4添加量為0.2%～0.3%時，蝦青素的含量不斷增加，并達到最大值118.7mg/L，繼續增加KH2PO4添加量，蝦青素的含量逐漸降低。因此，確定KH2PO4最佳添加量為0.3%。

圖4 KH2PO4的添加量對菌種產蝦青素的影響Fig.4 Effect of KH2PO4addition amount on astaxanthin production by the strain

2.2 響應面設計結果與分析

根據單因素結果，采用Design-Expert軟件分別對KH2PO4、MgSO4·7H2O，酵母膏，可溶性淀粉進行優化，實驗結果如表2所示。

用Design-Expert軟件，對表2進行多元回歸擬合，可以得到響應值影響顯著的回歸方程為：12.85X12-8.07X22-14.69X32-20.89X42，對回歸方程求一階偏導數，解得X1=0.32，X2=-0.4，X3=-0.36，X4=0.42即可換算得到：KH2PO40.4%，MgSO·47H2O 0.08%，酵母膏0.3%，可溶性淀粉1.2%，蝦青素理論產率達到155.3mg/L。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Response surface design and corresponding results

對回歸方程進行顯著性檢查、方差分析，結果如表3所示。

由表3可知，回歸模型系數顯著性檢驗結果：模型的一次項X4極顯著，X2顯著，其余不顯著，二次項X12、X32、X42極顯著，交互項都不顯著。表明各個影響因素與響應值不是簡單的線性關系。

方差的F值為8.25，Pr＞F值為0.004＜0.001，說明用上述回歸方程描述各因素與響應值之間的關系時，因變量和全體自變量之間的線性關系極顯著，即這種方法是可靠的。復相關系數R2=0.9059說明擬合度良好，實驗誤差小，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析和預測。經三次重復實驗結果可知蝦青素產率為149.4mg/L，接近預測值155.3mg/L，說明響應面法適用于對蝦青素菌種發酵工藝條件進行回歸分析和參數優化。根據中心復合設計結果做出三維響應面（圖5～圖8）。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model equation

圖5為MgSO4·7H2O和酵母膏對蝦青素產量的響應曲面圖和其投影的等高線圖，等高線圖形狀近乎圓形，表明MgSO4·7H2O和酵母膏兩個自變量之間交互效應較弱。圖6為可溶性淀粉和酵母膏對蝦青素產量的響應曲面圖和其投影的等高線圖，等高線圖形狀近乎圓形，表明可溶性淀粉和酵母膏兩個自變量之間交互效應較弱。圖7為KH2PO4和可溶性淀粉對蝦青素產量的響應曲面圖和其投影的等高線圖，等高線圖形狀近乎圓形，表明MgSO4·7H2O和酵母膏兩個自變量之間交互效應較弱。圖8為MgSO4·7H2O和酵母膏對蝦青素產量的響應曲面圖和其投影的等高線圖 ，等 高 線 圖 形 狀 近 乎 圓 形 ，表 明 MgSO4·7H2O 和 可溶性淀粉兩個自變量之間交互效應較弱。因此表明各個影響因素與響應值不是簡單的線性關系。

圖5 MgSO4·7H2O和酵母膏對蝦青素產量量的影響Fig.5 Effect of MgSO4·7H2O and yeast powder addition amount on astaxanthin produced by the strain

圖6 酵母膏和可溶性淀粉對蝦青素產量的影響Fig.6 Effect of starch and yeast powder addition amount on astaxanthin produced by the strain

圖7 KH2PO4和可溶性淀粉對蝦青素產量量的影響Fig.7 Effect of KH2PO4and starch addition amount on astaxanthin produced by the strain

圖8 MgSO4·7H2O和可溶性淀粉對蝦青素產量的影響Fig.8 Effect of starch and MgSO4·7H2O addition amount on astaxanthin produced by the strain

3 結論

利用實驗設計軟件Design-Expert，通過二次回歸設計得到了提高蝦青素產量的CTD004菌株與KH2PO40.4%，MgSO4·7H2O 0.08%，酵 母 膏0.3%，可 溶 性 淀 粉1.2%的回歸模型，經檢驗證明該模型是合理可靠的，能夠較好地預測蝦青素得率。在對影響蝦青素得率的關鍵因素及其相互作用進行探討后，得到的優化工藝參數為：KH2PO40.4%，MgSO4·7H2O 0.08%，酵母膏0.3%，可溶性淀粉1.2%時，蝦青素的理論值為155.3mg/L，驗證實驗結果為149.4mg/L。因此，利用響應面分析方法對蝦青素菌種發酵工藝進行優化，可獲得最優的工藝參數，從而為進一步的實驗研究奠定基礎。

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Response surface optimization of fermentation medium for astaxanthin by pseudomonas

LIU Yan1，FENG Yin1，MO Yan1，MIN Wei-hong2，MA Jing-xi1，*
（1.College of Biological and Food，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130600，China；2.Fermentation Engineering Laboratory，College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Response surface methodology was used to optimize fermentation medium for astaxanthin production by the strain.The highest astaxanthin yield of 149.4mg/L was achieved under the following conditions：KH2PO40.4% ，MgSO4·7H2O 0.08% ，yeast powder 0.3%and soluble starch 1.2%.In addition，the established regression model was found to had good effectiveness in predicting astaxanthin yield.

astaxanthin；pseudomonas；fermentation medium；response surface

TS202.3

A

1002-0306（2014）20-0186-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.032

2014－03－12

劉艷（1981-），女，碩士研究生，講師，研究方向：微生物發酵。

* 通訊作者：馬景喜（1981-）男，碩士研究生，講師，研究方向：功能性食品。

吉林省教育廳項目（2010-515）。