人毛囊外毛根鞘無色素性黑素細胞與白癜風

袁 睿 綜述，陳德宇 審校

白癜風是一種常見的原發性皮膚黏膜色素脫失癥，我國報道的社區人群發病率為0.09%～3.10%［1］,通常臨床上易診難治。現有研究證實，人毛囊外毛根鞘有一類無黑色素且未活化的黑素細胞（melanocytes，MC）［2-3］。它是由起源于神經嵴的MC 在人胚胎2～5周向表皮、毛囊遷移中滯留于外毛根鞘轉化來的。其不僅可為毛囊提供黑素母細胞，還可作為白癜風皮損區消失的MC 的主要來源。所以治療白癜風的研究熱點之一即為研究AMMC。現將其相關研究進展綜述如下。

1 AMMC的生物學特征

CUI等［2］于20世紀90年代發現AMMC主要位于毛囊外毛根鞘的中上部，數量少，常聚集分布，一般情況下處于休眠狀態，無黑素合成能力，屬于未分化的黑素細胞。體外光鏡下可觀察到AMMC胞體一般小于黑素細胞，折光度好，呈多角形。多為雙極，少數可為三級結構。原子力顯微鏡下可觀察到AMMC胞體為長梭形，有2～3個極突，極突與胞體分界不清，每個極突無二級分支或側枝，胞體與極突的側緣有許多微絨毛樣突起，向四周無規律伸展，形態各異。與表皮黑素細胞樹突內充滿單個或∕和聚集的黑素小體所不同的是，AMMC極突內未見清晰的顆粒狀隆起，僅在核周見許多直徑約300～500nm的黑素小體，多為Ⅱ、Ⅲ期，幾乎無成熟的Ⅳ期黑素小體［4］。透射電鏡下可觀察到：AMMC 為圓形、或橢圓形，包膜上的突起短且稀疏。胞體中央可見一卵圓形核，占胞體的30%～50%，多有一個核仁。胞質內最明顯的特點是含豐富的黑素小體，以Ⅱ、Ⅲ期為主，大小較為一致，均有單位膜包繞。線粒體多寡不一，僅于成熟黑素小體較多的細胞內可常見到。以上特征均體現了AMMC的不成熟性，因此AMMC 一般也不表達與黑素相關的酶分子，缺乏特異性分子標記［5］。所以可借助于NK1/beteb單抗和識別TYR,TRP1等聯合識別AMMC。其原因在于NK1/beteb 可識別未成熟黑素小體上的gp-100。運用免疫組化的方法，用以上的單抗或多抗標記之后可以觀察到：NK1/beteb 染色陽性細胞主要分布于生長期毛囊外毛根鞘中段，一般情況下均低于皮脂腺水平，數目較少，常群集分布。由于AMMC只表達前黑素小體相關抗原，這也證明了外毛根鞘功能的不成熟性［6］。

2 AMMC的培養

白癜風皮損區MC 缺失。再生的MC 來源于AMMC。如何刺激未成熟的且處于休眠狀態的AMMC 增值、分化、移行，已成為當今關注的熱點。但一直以來該細胞的分離與培養都被視為一難題，這也使得后續的研究無法繼續。AMMC最早由Tobin［7］在1995 年以膠原酶法培養成功，但其方法很難去除成纖維細胞的污染且所使用的培養基促進了AMMC的成熟。近期Tobin 等再次改良了培養基成分，但培養出的AMMC 仍然可產生黑素。目前，王大光等［8］對AMMC 的分離培養純化進行了最新的改良，并取得了成功，其方法如下：（1）與頭皮提供者溝通獲得同意后，記錄基本信息后取頭皮。（2）頭皮經碘伏消毒5 min，用PBS 液沖洗數次。（3）以眼科剪剪去脂肪組織及真皮上1 mm。再將頭皮剪成0.5 cm×1 cm 的皮片。（4）采用1%分離酶Ⅱ4℃消化24h，再37 ℃消化1h 后，眼科鑷輕輕擠壓使毛囊自動游離。用含5%小牛血清的DMEM 培養基沖洗3 次。（5）收集游離毛囊并切除毛乳頭，離心后純化毛囊。（6）0.5%胰蛋白酶37℃消化10～15 min 至外毛根鞘細胞大部分游離，血清終止消化，吹打形成細胞懸液后200 目銅網過濾，1500 r∕min離心5 min。（7）基礎培養基為MCDB153、谷氨酰胺、2%胎牛血清、干細胞因子、內皮素、bFGF、雙抗。將獲取的細胞懸液以1×107個∕ml接種并培養于37 ℃、5%CO2的孵箱中。2d 后通過更換培養基來去除未貼壁細胞。7～8d 后按3：1 的比例第1 次傳代。以后每5～7d 按1：2 比例傳代。傳至3 代即可獲得純化的AMMC。

3 AMMC與白癜風的治療

白癜風的復色主要依賴于AMMC在各種因素的激活下分化并遷移到色素脫失處。現對實驗及臨床中常見的各種激活物作如下總結：（1）甲氧沙林（8-MOP）可以直接促進鼠黑素母細胞，鼠黑素瘤細胞合成黑素［9-10］。CUI 等［2］也曾采用甲氧沙林加長波紫外線（PUVA）治療復色皮膚，治療后人毛囊外毛根鞘出現了大量的多巴反應陽性的MC。目前最新研究以首次傳代的AMMC 作為研究對象，經TYR、TRP-1和TRP-2 多克隆抗體研究間接免疫熒光標記，以含10、50、100umol/L 的甲氧沙林培養基培養可顯示：經甲氧沙林作用3d 后AMMC 樹突增多、延長、胞體變大，TYR表達量呈濃度依賴性增加，延長作用時間后TRP-1、TRP-2 表達也呈上升趨勢［11］。這均可表明甲氧沙林參與AMMC的活化過程。（2）1,25二羥維生素D3（VID）臨床上可運用于治療白癜風，目前的研究表明其作用機制為：①使AMMC 細胞體積增大樹突增長，形成具有多級樹突和強折光性的細胞。②可促進AMMC 的絡氨酸酶活性和黑素生成，并呈濃度依賴關系。③作用后可使AMMC 內黑素小體由Ⅰ、Ⅱ期向Ⅲ、Ⅳ大量轉化，線粒體增多、擴張。④促進TYR、TRP-1表達增強。（3）糖皮質激素作為臨床上最常用于治療白癜風的藥物，目前認為其作用機制主要作為免疫抑制劑直接作用于皮損以抑制白癜風皮膚中黑素細胞所受到的自身免疫的攻擊［12］及促進黑素的合成，但并無明確的研究以證明以上觀點。現已有學者使用倍他米松（BT）與AMMC共同孵育，其方法為：將傳至2 代的AMMC 以105/cm2 接種于6 孔培養板中，24h 后加入濃度為103,106,109mol/L 的BT，作用72h后分析TYR、TRP-1、TRP-2的表達。通過這個實驗他們課題組認為BT 可促進TYR、TRP-1 蛋白的表達并促進黑素小體的成熟，而TYR及TRP-1是MC成熟后合成黑素的關鍵酶。因此，可以推斷糖皮質激素促進黑素生成主要是通過激活AMMC并促進其增值而產生黑素從而治療白癜風的［13］。

綜上可知，AMMC 作為未活化的黑素細胞受到各種刺激因素作用后激活、分化、成熟。之后可以移行到白癜風的白斑區產生黑素，進而治愈白癜風。這為我們進一步研究如何治療白癜風提供了新的方向。

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