HPLC-示差折光檢測法測定白酒中三氯蔗糖的方法研究

趙云龍

（昆明市食品藥品檢驗所 昆明市食品藥品檢驗研究院，云南 昆明 650032）

三氯蔗糖又稱蔗糖素，是以蔗糖為原料經氯代衍生而成的一種非營養性甜味劑[1]。其性質穩定、熱值低、甜度是蔗糖的600～700倍[2-3]，我國自1997年批準使用，如今已被廣泛運用于各類食品中。近年來研究發現，三氯蔗糖及其水解產物具有一定的毒性，長期攝入或攝入過量會對人體生理機能造成傷害[4-11]，嚴格管控三氯蔗糖的安全使用勢在必行。

白酒是我國的傳統蒸餾酒，釀造、飲用歷史源遠流長。在GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中規定白酒中不得添加三氯蔗糖[12]，但白酒生產歷史由古至今，生產作坊標準不一、工藝參差不齊、管理不到位、食品安全意識淡薄，部分生產者為改善口感，掩蓋酒體的酸苦澀雜味，非法人為添加三氯蔗糖等添加劑。改進并建立簡單快速有效的檢測方法，有利于促進白酒行業的健康發展[13-14]。

目前文獻報道中，三氯蔗糖的測定方法有高效液相色譜-質譜法[15-21]、氣相色譜法[22]、滴定法[23]、固相萃取法[24-25]、高效液相色譜法[26-31]、毛細管電泳法[32]、離子色譜法[33-35]等。這些方法或過程繁瑣，或儀器昂貴，或分析時間長。目前采用高效液相色譜-示差折光檢測法測定三氯蔗糖的研究尚少。本研究通過從不同維度、不同梯度進行逐一實驗分析，從而確定高效液相色譜-示差折光檢測法測定白酒中三氯蔗糖的最適宜條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三氯蔗糖標準品（99.7%）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈（色譜純）：美國Avantor公司；0.22 μm有機相濾膜：天津津騰實驗設備有限公司。

1.2 儀器與設備

Waters bridge C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：美國沃特世科技有限公司；1260 Infinity高效液相色譜儀（配示差檢測器G1362A）：美國安捷倫科技有限公司；MS 105DU十萬分之一電子天平：美國METTLER TOLEDO公司；arium?comfort Ⅱ純水超純水一體機：德國賽多利斯集團。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

準確稱取三氯蔗糖標準品0.050 00 g（精確至0.000 01 g）于50 mL容量瓶中，加純水定容至刻度，搖勻，得到質量濃度為1.00 g/mL標準中間液。根據需要，取適量中間液用純水逐級稀釋至適當濃度的標準工作液。

1.3.2 實驗步驟

采用高效液相色譜示差法，從流動相比例、流速、進樣量、柱溫、示差檢測池溫度五個方面、不同梯度進行考察。分別考察不同體積分數的乙腈溶液（11%、15%、20%、25%、30%），流速（0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min、1.4 mL/min）、進樣量（10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL）、柱溫（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、檢測池溫度（20 ℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45 ℃）對試驗結果的影響，取6次的平均值進行統計分析，綜合實驗成本和檢測效率等因素，確定高效液相色譜示差法測定白酒中三氯蔗糖的最佳色譜條件。

1.3.3 試樣制備

試樣經0.22 μm有機相微孔濾膜過濾，直接取濾液上機分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相的選擇

在流速1.0 mL/min、進樣量20 μL、柱溫35 ℃、示差檢測池溫度35 ℃時，分別配制體積分數分別為11%、15%、20%、25%、30%五個梯度的乙腈水溶液（混合），考察流動相中乙腈體積分數與三氯蔗糖保留時間的關系，每個梯度做6次平行實驗，取6次的平均值繪圖，結果見圖1。

圖1 流動相中乙腈體積分數與三氯蔗糖保留時間的關系Fig.1 Relationship between acetonitrile volume fraction and retention time of sucralose in mobile phase

由圖1可知，三氯蔗糖保留時間隨著流動相乙腈體積分數的增加而減小。當乙腈體積分數＜20%時，三氯蔗糖保留時間呈現明顯減小趨勢。當乙腈體積分數＞20%時，三氯蔗糖保留時間減小趨勢變緩。當乙腈體積分數＞25%時，三氯蔗糖保留時間減小趨勢甚微。在色譜峰穩定的前提下，保留時間越短越好。選擇乙腈∶水=（20∶80，V/V）為適宜流動相。

2.1.2 流動相流速的選擇

在流動相為乙腈∶水=（20∶80，V/V）、進樣量20 μL、柱溫35 ℃、示差檢測池溫度35 ℃時，分別設定0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min、1.4 mL/min五個梯度流速，考察流速與三氯蔗糖保留時間和色譜峰面積的關系，每個梯度做6次平行實驗，取6次的平均值繪圖，結果見圖2。

圖2 流動相流速與三氯蔗糖保留時間、峰面積的關系Fig.2 Relationship between mobile phase velocity and retention time and peak area of sucralose

由圖2可知，三氯蔗糖保留時間和色譜峰面積隨著流動相流速的增加而呈現平緩減小趨勢。當流動相流速低時，色譜峰面積大，說明分析靈敏度高，但保留時間相對要長，操作成本高且耗時。當流動相流速高時，色譜峰面積小，說明分析靈敏度有所降低。綜合考慮，選擇1.0 mL/min為適宜流動相流速，既可以保證分析靈敏度，又可以適當縮短分析時間，提高分析效率。

2.1.3 進樣量的選擇

在流動相為乙腈∶水=（20∶80，V/V）、流速1.0 mL/min、柱溫35 ℃、示差檢測池溫度35 ℃時，分別設定10 μL、15 μL、20μL、25μL、30 μL五個梯度進樣量，考察進樣量與三氯蔗糖保留時間和色譜峰面積的關系，每個梯度做6次平行實驗，取6次的平均值繪圖，結果分別見圖3、圖4。

圖3 進樣量與三氯蔗糖保留時間的關系Fig.3 Relationship between injection volume and retention time of sucralose

圖4 進樣量與峰面積的關系Fig.4 Relationship between injection volume and peak area

由圖3和圖4可知，三氯蔗糖保留時間和色譜峰面積隨著進樣量的增加而增加。當進樣量＞20 μL時的三氯蔗糖保留時間和色譜峰面積的線性較進樣量10～20 μL時的線性呈現出明顯的波動，說明分析靈敏度有所降低。綜合考慮，選擇20 μL為適宜進樣量。

2.1.4 柱溫的選擇

在流動相為乙腈∶水=（20∶80，V/V）、流速1.0 mL/min、進樣量20 μL、示差檢測池溫度35 ℃時，分別設定20 ℃、25 ℃、30℃、35℃、40℃五個梯度柱溫，考察柱溫與三氯蔗糖保留時間的關系，每個梯度做6次平行實驗，取平均值，結果見圖5。

圖5 柱溫與三氯蔗糖保留時間的關系Fig.5 Relationship between column temperature and retention time of sucralose

由圖5可知，三氯蔗糖保留時間隨著柱溫的升高而減小。柱溫升高，物質傳遞速率加快，保留時間縮短，分析靈敏度提高。但柱溫過高會造成物質傳遞速率過快，影響組分的分離，同時可能會造成柱子內部結構坍塌，損壞柱子。綜合考慮，選擇35 ℃為適宜柱溫。

2.1.5 檢測池溫度的選擇

在流動相為乙腈∶水=（20∶80，V/V）、流速1.0 mL/min、進樣量20 μL、柱溫35 ℃時，分別設定20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃六個梯度檢測池溫度，考察示差檢測池溫度與三氯蔗糖保留時間的關系，每個梯度做6次平行實驗，取平均值，結果見圖6。

圖6 檢測池溫度與三氯蔗糖保留時間的關系Fig.6 Relationship between RID cell temperature and retention time of sucralose

由圖6可知，示差檢測池溫度與三氯蔗糖保留時間之間并未有明顯的線性關系。當檢測池溫度低于35 ℃和高于40 ℃時，保留時間線性極不穩定。當檢測池溫度35～40 ℃時，保留時間呈現相對穩定趨勢。綜合考慮，選擇35 ℃為適宜檢測池溫度。

綜合上述實驗，高效液相色譜法分析三氯蔗糖的適宜色譜條件為流動相乙腈∶水=（20∶80，V/V）、流速1.0 mL/min、進樣量20 μL、柱溫35 ℃、示差檢測池溫度35 ℃。

2.2 標準曲線建立及方法驗證

2.2.1 標準曲線的繪制

配制0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL系列三氯蔗糖標準溶液，在上述適宜條件下進行分析，以三氯蔗糖保留時間定性、以峰面積定量，得到標準曲線見圖7。由圖7可知，三氯蔗糖回歸方程為：y=149 669x-106，相關系數R2=0.999 94。可見，三氯蔗糖質量濃度在0.01～0.4 mg/mL范圍內呈現出較好的線性關系。

圖7 三氯蔗糖溶液的標準曲線Fig.7 Standard curve of sucralose solution

2.2.2 檢出限和定量限

配制適宜濃度的三氯蔗糖標準溶液，在上述適宜色譜條件下平行測定3次，分別按照信噪比（signal to noise ratio，S/N）=3和S/N=10計算出方法檢出限和定量限，結果見表1。

表1 方法檢出限和定量限Table 1 Detection limit and quantification limit of the method

由表1可知，該方法測定白酒中三氯蔗糖，其檢出限為3.538 μg/mL，定量限為11.79 μg/mL，均小于食品安全國家標準GB 22255—2014《食品安全國家標準食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》[36]。

2.2.3 精密度實驗

配制7組不同質量濃度的三氯蔗糖溶液，每組濃度分別做7個平行樣，每個樣品平行測定3次，取3次的平均值，計算得到標準偏差和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值，結果見表2。

表2 精密度試驗結果Table 2 Results of precision tests

由表2可知，7組不同濃度的三氯蔗糖溶液涵蓋了標線的整個線性范圍，從低濃度到高濃度，每一濃度的7個平行樣重復性較好。三氯蔗糖測定結果的相對標準偏差（RSD）在0.6%～6.6%之間，表明該方法精密度良好，且濃度越高，精密度相對越好。

2.2.4 加標回收率試驗

取3組空白樣，分別加入質量濃度為0.012 6 mg/mL、0.037 6 mg/mL、0.126 4 mg/mL三氯蔗糖標準溶液1 mL。每組做7個平行樣，每個樣品平行測定3次，取3次的平均值，計算加標回收率及其RSD值，結果見表3。

表3 加標回收率試驗結果Table 3 Results of standard recovery rate tests

由表3可知，三氯蔗糖的加標平均回收率為96.3%～103.4%，其RSD值為1.0%～2.8%，表明該方法準確度高，滿足GB 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》[37]要求。

2.2.5 樣品測定

隨機選取市售10個白酒試樣，每個試樣做兩個平行樣，分別吸取適量，經0.22 μm濾膜過濾，取濾液直接上機。在上述適宜色譜條件下，每個樣品平行進樣3次。10個白酒試樣均未檢出三氯蔗糖，符合GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[12]規定。

3 結論

采用高效液相色譜示差法測定白酒中三氯蔗糖含量的方法，使用C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），在流動相乙腈∶水=（20∶80，V/V）、流速1.0 mL/min、進樣量20 μL、柱溫35 ℃、示差檢測池溫度35 ℃條件下，三氯蔗糖在質量濃度0.01～0.40mg/mL范圍內，線性關系好，相關系數R2=0.99994。在上述適宜條件下進行分析測定，結果表明，精密度試驗結果相對標準偏差在0.6%～6.6%之間，檢出限為3.538 μg/mL，定量限為11.79μg/mL，加標平均回收率為96.3%～103.4%。該方法簡單快捷，定量準確，適用于白酒中三氯蔗糖含量的大規模、大批量快速檢測。