人結腸癌細胞中CacyBP/SIP核轉位差異表達基因的驗證*

王安萍 趙盈盈 劉 欣 翟惠虹

鈣周期素結合蛋白（CacyBP/SIP）是一種可以和鈣周期素（S100A6）結合大小約30 ku的蛋白質。在結腸癌細胞中CacyBP/SIP主要定位于細胞質中，研究發現胃泌素、KCl[1]等作為刺激因子及缺氧[2]狀態可使CacyBP/SIP核轉位。為篩選出CacyBP/SIP核轉位下游差異表達基因，本課題組在前期工作中成功構建了hCacyBP/SIP基因的胞核定位載體[3]，并將載體成功包裝入慢病毒，取病毒上清和陰性對照上清感染人源性結腸癌SW480細胞，完成細胞周期聚合酶鏈反應（PCR）芯片，共篩選出88個差異表達基因。為排除人為導致胞核中CacyBP/SIP過表達篩選出差異表達基因的假陽性，同時明確在生理條件下CacyBP/SIP發生核轉位后是否有相同差異表達基因，本研究選取差異表達倍數大于2的基因周期素依賴性蛋白激酶8（cyclin dependent kinase 8，CDK8）和細胞周期蛋白依賴性激酶亞基2（cyclin depen?dent kinase subunit 2，CKS2），并采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術進行驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人源性結直腸腺癌細胞SW480購自北京協和細胞庫；RPMI-1640培養液為Hyclon公司，胎牛血清、0.25%胰酶購自Gibco公司，胞漿、胞核蛋白抽提試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒為南京凱基公司，胃泌素購自Abcam公司，CacyBP/SIP兔抗人單抗購自CST公司，PCNA鼠抗人單克隆抗體購自Abbkine公司，β-actin鼠抗人單抗、辣根酶標記羊抗兔/鼠IgG購自北京中杉。Trizol購自Invitrogen公司，cDNA反轉錄試劑盒為MBI公司產品，熒光定量PCR試劑盒購自promega公司，引物序列由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人結直腸腺癌細胞SW480在37℃、5% CO2、10%胎牛血清的RPMI1640培養液培養，待細胞生長狀態良好，更換為無血清培養液培養24 h后，對照組SW480細胞繼續無血清培養液培養，實驗組細胞更換胃泌素濃度為1×10-7mol/L的無血清、無雙抗培養液分別培養24、48 h。

1.2.2 免疫蛋白印跡（Western blot）檢測胃泌素刺激前后CacyBP/SIP在細胞內的定位和表達 棄去培養液按試劑盒說明分別提取實驗組和對照組細胞胞漿、胞核蛋白，BCA法蛋白定量。10%分離膠，110 V電壓電泳120 min。半干轉膜，5%脫脂奶粉封閉2～4 h，孵育一抗anti-CacyBP/SIP（1∶600），4℃過夜，二抗HRP標記羊抗兔（1∶5 000），洗膜，曝光。胞漿蛋白內參β-actin（1∶400），胞核蛋白內參PCNA（1∶1 000)。

1.2.3 細胞總RNA提取、反轉錄 Triozl法分別提取實驗組胃泌素作用48 h的SW480細胞和對照組SW480細胞總RNA，檢測光密度（OD）值在1.8～2.1之間的RNA,按照反轉錄試劑盒說明反轉錄成cDNA。

1.2.4 qRT-PCR檢測胃泌素刺激前后CDK8、CKS2基因表達水平 cDNA模板2 μL，上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），2×Go Taq?Master PCR Mix 10 μL，無酶水補充為總體積至20 μL反應體系；反應條件：預變性95℃2 min;擴增反應95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s。檢測熒光，共55個循環。平行重復實驗3次。擴增反應引物序列見表1。反應結束后得到每個目的基因和管家基因β-actin的Ct值，用目的基因和管家基因Ct值差值進行統計學分析；用2-△△Ct法計算實驗組和對照組基因差異表達倍數。

Table 1 The PCR primer and the Tm of genes表1 PCR擴增反上下引物序列及Tm值

1.3 統計學方法 用SSPS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，2組間均數比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃泌素刺激前后CacyBP/SIP在細胞內的定位和表達 選胃泌素作為刺激因子，誘導CacyBP/SIP發生核轉位。無胃泌素刺激時CacyBP/SIP主要在細胞質中表達，胞核中僅少量表達。給予1×10-7mol/L胃泌素分別刺激24、48 h后，可同時在細胞質和細胞核中檢測到CacyBP/SIP的表達，見圖1。且胃泌素作用48 h的效果較24 h明顯，說明胃泌素成功誘導CacyBP/SIP入核。

Figure 1 The expression of CacyBP/SIP in cytoplasm and nuclear detected by Western blot assay before and after stimulation圖1 Western blot檢測胃泌素刺激前后CacyBP/SIP在胞質及胞核中的定位

2.2 qRT-PCR結果 在CacyBP/SIP核轉位前后，基因CDK8和CKS2在細胞SW480中的變化差異方向同芯片結果一致，CDK8和CKS2兩目的基因均表達上調，見圖2、3。且實驗組和對照組中兩基因表達差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。其中基因CDK8的倍數變化為2.38，基因CKS2的倍數變化為2.25。

Figure 2 The amplification curves of real-time quantitative PCR圖2 qRT-PCR擴增曲線

Figure 3 The dissociation curves of real-time quantitative PCR圖3 qRT-PCR溶解曲線

Table 2 Comparison of expression changes of CDK8 and CKS2 genes before and afterstimulation表2 胃泌素刺激前后基因CDK8、CKS2表達變化比較（△Ct,±s）

Table 2 Comparison of expression changes of CDK8 and CKS2 genes before and afterstimulation表2 胃泌素刺激前后基因CDK8、CKS2表達變化比較（△Ct,±s）

＊P＜0.05

組別實驗組對照組t n33 CDK8 10.35±0.37 11.60±0.59 3.129＊CKS2 4.59±0.43 5.76±0.51 3.053＊

3 討論

3.1 胃泌素誘導CacyBP/SIP核轉位使得基因CDK8和CKS2發生差異表達 翟惠虹等[1]發現在結腸癌細胞中胃泌素可刺激主要表達在細胞質中的CacyBP/SIP蛋白發生核轉位，這種核轉位具有Ca2+濃度依賴現象，同時伴有蛋白磷酸化現象。蛋白在細胞中表達定位與其生物學功能密切相關，CacyBP/SIP在胃泌素刺激下發生核轉位和磷酸化，提示其可能作為信號分子傳遞信息從而參與細胞功能的調節。為明確在生理條件下CacyBP/SIP核轉位是否會有相同差異表達基因，本研究選擇用胃泌素作為刺激因子，誘導CacyBP/SIP入核,結果顯示胃泌素誘導 Ca?cyBP/SIP入核后基因CDK8、CKS2表達上調，這與PCR芯片結果一致,說明在胞核中CacyBP/SIP過表達情況下篩選出差異基因表達趨勢同胃泌素誘導CacyBP/SIP核轉位后結果一致。

3.2 CDK8和結腸癌的關系 Firestein等[4]研究發現在人類結腸癌細胞中CDK8轉錄水平對細胞周期和細胞生長的調控發揮重要作用，因而被提議為早期致癌基因。Firestein等[5]還發現CDK8參與由βcatenin介導的原癌基因激活。He等[6]發現在結腸癌細胞中，CDK8表達量降低后通過降低β-catenin表達及阻滯細胞G0/G1期的轉換，進而抑制細胞增殖、促進細胞凋亡。這表明CDK8通過影響β-catenin的表達量進而調節結腸癌細胞生物學活動。

3.3 CKS2與結腸癌的關系 基因CKS2是CKS家族成員之一，可催化亞基結合形成復合物。過表達的CKS2在細胞應激情況下阻斷DNA復制的S期內檢查點，使DNA持續性復制進而調控細胞周期進程[7]。CKS2在細胞減數分裂過程中具有非常重要的作用，是生殖細胞從減數第1次分裂中期到后期的必要條件[8]。研究發現在膀胱癌[9]、食管癌[10]、胃癌[11]、膽管癌[12]等惡性腫瘤中CKS2均呈高表達，且與腫瘤的侵襲性和預后不良密切相關，進而有望成為一種新的腫瘤生物學標志物。與正常組織、癌旁組織相比較，CKS2在結腸癌中也呈現高表達[13]。

3.4 CacyBP/SIP與腫瘤的發生發展關系 在不同腫瘤細胞中CacyBP/SIP發揮不同的生物學作用，在腎癌細胞中其可能通過降低β-catenin表達量使CyclinD1蛋白表達下調，進而阻礙細胞周期的進展[14]；在胰腺癌細胞中其通過促進細胞周期G1/S期的轉換進而促進胰腺癌細胞增殖[15]；在胃癌細胞中CacyBP/SIP可通過對β-catenin表達和T細胞因子/淋巴增強因子（Tcf/LEF）轉錄激活的影響進而抑制胃癌細胞的增殖[16]。以上研究表明CacyBP/SIP在腫瘤細胞中大多數是通過對細胞周期調控及β-catenin活動調節而參與腫瘤細胞生物學活動的。

綜上，本研究發現胃泌素可刺激CacyBP/SIP發生核轉位；同時也證明在CacyBP/SIP過表達情況下完成的細胞周期PCR芯片所篩選出來的差異表達基因同生理條件下CacyBP/SIP核轉位后的差異表達基因一致，對篩選出來的差異表達基因與CacyBP/SIP的關系值得進一步研究。

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