草果甲醇溶出物對D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化作用機理研究

閆 倩，俞龍泉，陳 野，王宏濤，張秋艷，魏 剛

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457；2.石家莊學院化工學院，河北石家莊050035；3.河北以嶺醫藥研究院，河北石家莊050035）

草果甲醇溶出物對D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化作用機理研究

閆 倩1，俞龍泉2，*，陳 野1，王宏濤3，張秋艷3，魏 剛3

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457；2.石家莊學院化工學院，河北石家莊050035；3.河北以嶺醫藥研究院，河北石家莊050035）

目的：了解明草果甲醇溶出物對D-半乳糖所致衰老小鼠的抗氧化功效。方法：采用D-半乳糖結合高脂飼料建立ICR小鼠衰老模型，高、低劑量組分別添加草果溶出物200、100mg/kg，考察血漿和肝組織中SOD、GSH、GSH-Px、MDA、8-ISO-PGF2α指標。結果：以模型為參照，血指標顯示，草果組SOD活力極顯著提高（p＜0.01），草果組GSH含量均極顯著提高（p＜0.01），GSH-Px活力也極顯著提高（p＜0.01），草果組MDA含量均顯示顯著降低（p＜0.05），高劑量組8-ISOPGF2α含量顯著降低（p＜0.05）；肝指標顯示，低劑量組SOD活力顯著提高（p＜0.05），高劑量組差異極顯著（p＜0.01），高劑量組GSH含量極顯著提高（p＜0.01），能極顯著提高GSH-Px活力（p＜0.01），極顯著降低MDA含量（p＜0.01）；結論：草果甲醇溶出物能夠顯著提高小鼠SOD、GSH、GSH-Px指標，MDA和8-ISO-PGF2α含量顯著下降。

草果，甲醇溶出物，D-半乳糖，抗氧化作用，小鼠

草果（Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire），又 名草果子、草果仁，分布于我國云南、廣西、貴州等地，為姜科豆蔻屬多年生常綠叢生草木植物。草果是一種藥食同源植物，具有特殊風味和藥用價值[1-2]。作為常用的中藥，草果有健胃、順氣、驅風、增進食欲的藥療效果，同時具有燥濕健脾、溫胃止痛、止嘔截瘧的功能，能用于寒濕內阻、臟腹脹滿、嘔逆、不思飲食等癥[3]。草果的干燥果實氣香、性溫、味辛辣，在國內廣泛應用于食品香料行業。

自由基連鎖反應引起的脂質過氧化會導致細胞損傷、衰老或死亡，與人體許多疾病及衰老密切相關[4-5]，因此人體攝入抗氧化功能因子顯得尤為重要。前期研究發現草果比其他香辛料具有更好的抗氧化性[6]，關于草果及其功效成分的抗氧化機理研究，到目前為止國內外還沒有發現相關報道。本研究的目的是探討草果中生物活性物質的體內抗氧化作用，解明其對D-半乳糖所致衰老小鼠的抗氧化機理。本研究參照中國食品藥品監督管理局2012年發布的《抗氧化功能評價方法》[7]，以D-半乳糖所致衰老小鼠作為實驗對象，給予不同組小鼠普通飼料、高脂飼料及添加不同劑量草果甲醇溶出物的實驗飼料，進行小鼠體內抗氧化功能的研究，從小鼠血漿及肝組織抗氧化酶水平（SOD、GSH-Px的活性）、肽水平（GSH的含量）和脂質過氧化產物（8-ISO-PGF2α、MDA的含量）三個方面，解明草果甲醇溶出物的抗氧化作用機理，為開發第三代保健食品新品種提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草果 產于云南；豬油 臺灣正義食品有限公司；小鼠基礎飼料 購于河北醫科大學動物實驗中心，為粉末狀；甘油三酯（TG）檢測試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）檢測試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）檢測試劑盒、總膽固醇（TC）檢測試劑盒 均購于北京九強生物技術有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）測定測試盒、還原型谷胱甘肽（GSH）測定測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒、BCA法測定超微量蛋白含量試劑盒、小鼠8-異前列腺素F2α（8-ISO-PGF2α）酶聯免疫檢測試劑盒 均購于南京建成生物工程研究所；D-半乳糖 天津市沃爾斯化工有限公司；甲醇、氯仿 分析純，天津市河東區紅巖試劑廠；丙酮 分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；SPF級ICR 8周齡雄性小鼠 體重28～32g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2012-0001。

日立7080全自動生化分析儀 日本日立公司；RT-6000全自動酶標儀 美國雷杜公司；H2050R臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 草果甲醇溶出物的制備 草果去殼后烘干，粉碎成100目以上粉末。稱取50g草果粉末，加入200mL氯仿，400mL甲醇和40mL蒸餾水，靜置過夜，用均質機均質5min（18000r/min），冷卻后用超聲波細胞粉碎儀粉碎10min（功率70%，工作頻率20～25Hz）?；旌衔镎婵粘闉V后收集濾液，濾餅加入100mL氯仿，200mL甲醇，20mL蒸餾水，再次利用上述方法萃取有效物質，重復兩遍。將三次濾液收集到一起，并加入60g已活化硅膠粉末，利用旋轉蒸發儀蒸干，旋轉蒸發儀溫度設為25℃，得到粉末狀樣品后，進行干法上柱（自制50?×250mm的200～300目硅膠氫柱）。先后用600mL氯仿、600mL丙酮、600mL甲醇洗脫，收集甲醇溶出液[23-24]。將甲醇溶液用微孔濾膜（0.22μm）過濾后進行蒸發濃縮，待濾液量小于50mL時真空干燥，最終得到草果甲醇溶出物，提取率約為2%。

1.2.2 實驗飼料的制備 高脂飼料：在基礎飼料基礎上，添加10%的豬油；低劑量實驗飼料：在高脂飼料基礎上，添加100mg/kg的草果甲醇溶出物；高劑量實驗飼料：在高脂飼料基礎上，添加200mg/kg的草果甲醇溶出物。

1.2.3 動物分組、造模及處理

1.2.3.1 動物分組 取8周齡ICR雄性小鼠，體重28～32g，隨機分成4組，每組12只，設為空白對照組、模型對照組、草果低劑量實驗組、草果高劑量實驗組。在不銹鋼絲籠中飼養動物。給予小鼠普通棒狀飼料2周后，進行粉末飼料的適應性喂養。小鼠在第12周齡時用苦味酸進行編號，開始進行90d喂養實驗。

1.2.3.2 動物造模及飼養 模型對照組、草果低劑量實驗組及草果高劑量實驗組用D-半乳糖致亞急性衰老法造模，劑量為125mg/（kg·d），腹腔注射8周，注射體積是0.1mL/（10g·bw），每天依據體重調整注射劑量。空白對照組腹腔注射等量生理鹽水，同時，空白對照組給予普通飼料，模型對照組給予高脂飼料，草果低劑量實驗組給予低劑量實驗飼料，草果高劑量實驗組給予高劑量實驗飼料。每周記錄食量及體重。動物房溫度保持在（24±0.5）℃，相對濕度保持在65% ±5%。室內照明包括光明與黑暗的12h交替。

1.2.3.3 動物血液及肝組織的采集 在飼養結束時，所有小鼠禁食20h，用乙醚麻醉，解剖收集血液并取肝組織。將肝組織進行稱重，將肝組織和剖前體重的比值作為肝臟指數。取血時，用檸檬酸鈉抗凝，4℃，3000r/min離心15min，取上清液-30℃保存待測。取小鼠肝臟0.5g，放入研磨器中，加入4.5mL生理鹽水，制成10%的肝勻漿，振蕩，4℃，3000r/min離心20min，取上清液，-30℃保存備用。

1.2.4 指標測定 血漿采用全自動生化分析儀依據試劑盒說明書測定TG[8]、LDL-C[9]、HDL-C[10]、TC[11]含量。血漿及肝臟中SOD[12]、GSH[13]、MDA[14]、GSH-Px[15]含量均按試劑盒說明進行測定。肝臟蛋白定量按試劑盒說明用BCA法[16]測定。血漿中8-ISO-PGF2α[17]含量按ELISA試劑盒說明進行測定。

1.3 數據處理

實驗數據用完全隨機設計的獨立樣本t檢驗，以平均數±標準差（）表示，用SPSS 13.0統計軟件處理。p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 對小鼠體重及肝臟指數的影響

圖1表示對小鼠體重及肝臟指數的影響，由圖1（A）可見，隨著飼養時間的增加，各組小鼠體重均呈現出不同的增加趨勢，與模型對照組相比，草果低劑量組、高劑量組的初始體重、中期體重、解剖前體重均無顯著性差異（p＞0.05）?？瞻讓φ战M、模型對照組、草果低劑量組、草果高劑量組的平均日進食量分別為（5.08±0.26）、（5.00±0.18）、（4.90±0.11g）、（4.88± 0.12）g，各組間平均日進食量均無顯著差異（p＞0.05），說明草果甲醇溶出物對小鼠的正常生長及體重沒有顯著的影響。由圖1（B）可見，草果實驗組與模型對照和空白組相比，肝臟指數雖有差別，但各組之間比較，經統計學分析無顯著性差異（p＞0.05），說明草果甲醇溶出物對小鼠肝臟生理沒有顯著影響。

圖1 各組小鼠體重的變化及肝臟指數的變化Fig.1 Body weight and ratio of liver to body weight

2.2 對小鼠血脂指標的影響

圖2表示對小鼠血漿中甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、總膽固醇含量的影響，由圖2A可見，模型組甘油三酯含量比空白對照組有增加趨勢，但無顯著性差異（p＞0.05），與模型組相比，草果低劑量組能明顯降低TG的含量，差異極顯著（p＜0.01），草果高劑量組，雖有降低趨勢，但無顯著性差異（p＞0.05）。由圖2（B～D）可見，各組間LDL-C、HDL-C、TC含量雖然有所差別，但無顯著性差異（p＞0.05）。

2.3 對小鼠抗氧化指標的影響

圖3表示對小鼠肝組織及血漿中SOD活力的影響。由圖3（A）可見，模型對照組肝組織SOD活力與空白對照組相比極顯著降低（p＜0.01），與模型對照組相比，草果低、高劑量組均能升高肝組織SOD活力水平，均存在極顯著差異（p＜0.01）。由圖3（B）可見，模型對照組血漿SOD活力與空白對照組相比顯著降低（p＜0.05），與模型對照組相比，草果低劑量組能顯著升高血漿SOD活力水平（p＜0.05），高劑量組能極顯著升高SOD活力水平（p＜0.01），此外，與草果低劑量組相比，草果高劑量組可顯著提高血漿SOD活性（p＜0.05），且高劑量組與空白對照組相比血漿SOD活力極顯著升高（p＜0.01），以上結果表明草果甲醇溶出物能夠有效的提高SOD的活性。

圖2 各組小鼠血漿甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、總膽固醇含量的變化Fig.2 Triglyceride，low density lipoprotein，high density lipoprotein，total cholesterol

圖4表示對小鼠肝組織及血漿中GSH含量的影響。由圖4（A）可見，模型對照組肝組織GSH含量與空白對照組相比極顯著降低（p＜0.01），與模型對照組相比，草果低劑量組有升高肝組織GSH水平的趨勢，但無顯著性差異（p＞0.05），草果高劑量組能極顯著升高肝組織GSH水平（p＜0.01）。由圖4（B）可見，模型對照組血漿GSH含量與空白對照組相比極顯著降低（p＜0.01），與模型對照組相比，草果低、高劑量組均能極顯著升高血漿GSH含量（p＜0.01），此外，與草果低劑量組相比，草果高劑量組可顯著增加血漿GSH含量（p＜0.05），與空白對照組相比，草果低、高劑量組也均能極顯著升高血漿GSH含量（p＜0.01），表明草果甲醇溶出物能夠有效增加體內GSH含量。

圖3 不同飼料組小鼠肝組織及血漿中SOD活力的變化Fig.3 SOD activity in mice fed the control and experimental diets

圖4 不同飼料組小鼠肝組織及血漿中GSH含量的變化Fig.4 The content of GSH in mice fed the control and experimental diets

圖5表示對小鼠肝組織及血漿中GSH-Px活力的影響。由圖5（A）可見，模型對照組肝組織GSH-Px活力與空白對照組相比極顯著降低（p＜0.01），與模型對照組相比，草果低、高劑量組均能升高肝組織GSHPx活力水平，且均存在極顯著差異（p＜0.01），此外，與草果低劑量組相比，草果高劑量組可顯著提高肝組織GSH-Px活性（p＜0.05）。由圖5（B）可見，模型對照組血漿GSH-Px活力與空白對照組相比極顯著降低（p＜0.01），與模型對照組相比，草果低劑量組有升高血漿GSH-Px活力水平的趨勢，但無顯著性差異（p＞0.05），草果高劑量組能極顯著升高血漿GSH-Px活力水平（p＜0.01），此外，與模型對照組相比，草果高劑量組可顯著提高血漿GSH-Px活性（p＜0.05），說明血漿GSH-Px活性與草果甲醇溶出物的用量關系密切。

圖5 不同飼料組小鼠肝組織及血漿中GSH-Px活力的變化Fig.5 GSH-Px activity in mice fed the control and experimental diets

圖6表示對小鼠肝組織和血漿中MDA含量及小鼠血漿中8-ISO-PGF2α含量的影響。由圖6（A）可見，模型對照組肝組織脂質過氧化物MDA含量與空白對照組相比極顯著升高（p＜0.01），與模型對照組相比，草果低、高劑量組均能顯著降低肝組織MDA含量（p＜0.05）。由圖6（B）可見，模型對照組血漿MDA含量與空白對照組相比極顯著升高（p＜0.01），與模型對照組相比，草果低劑量組、高劑量組均能極顯著降低血漿MDA含量（p＜0.01）。由圖6（C）可見，模型對照組血漿8-ISO-PGF2α含量與空白對照組相比極顯著升高（p＜0.01），與模型對照組相比，草果低劑量組有降低血漿8-ISO-PGF2α含量的趨勢，但無顯著性差異（p＞0.05），草果高劑量組能顯著降低血漿8-ISO-PGF2α含量（p＜0.05）。

3 討論

對小鼠長期注射D-半乳糖是制備小鼠衰老模型的經典方法[18-19]。小鼠對高脂飼料的攝入將導致其甘油三酯和總膽固醇升高，增加肝臟代謝的負擔，會加速機體衰老進程或引發相關疾病[20-21]。本實驗利用D-半乳糖聯合高脂飼料建立小鼠衰老模型，與空白對照組相比，模型對照組小鼠呈現明顯衰老體征，血脂指標存在差異，抗氧化指標差異顯著（p＜0.05），說明該方法建立的小鼠衰老模型效果良好，可應用于抗衰老保健品的研究。如圖2所示，與模型對照組相比，草果低劑量組的TG含量明顯降低，并有顯著性差異，而高劑量組差異不明顯；草果低劑量組、高劑量組均有降低血脂LDL-C、TC含量的趨勢和升高HDL-C含量的趨勢，但無顯著性差異。這與我們前期研究結論一致，即草果不僅能夠降低血糖，還具有降血脂和減肥的功效，其甲醇溶出組分中的特殊極性脂溶性物質可降低甘油三酯[6]。另外，呂美[32]通過ABTS、DPPH和FRAP法對17種常見香辛料的抗氧化作用的研究表明，草果具有較好的清除自由基的能力。李婷[22]以16種香辛料為研究對象，準確稱取各香辛料5g，與乙醇按照1∶50（g/mL）進行浸泡6h，超聲波萃取60min，抽濾，60℃恒溫下烘干，對香辛料提取物進行DPPH清除率測定，發現草果的DPPH清除率最高，為0.82790，表明草果具有很好的抗氧化活性。我們前期的研究結果也表明草果具有很好的抗氧化活性[23-24]。宋啟示[25]將草果干果（5.0kg）經搗碎后用甲醇加熱回流提取3次。提取液合并后減壓濃縮至無甲醇，混懸于水，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到石油醚萃取物（74g）、氯仿萃取物（69g）、乙酸乙酯萃取物（28g），正丁醇萃取物（28g）和水層部分（99g）。氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取物分別用硅膠和反相硅膠柱層析進行反復分離，分離到13個化學成分，經鑒定，其中3個為結構類型不同的新化合物，即草果素（tsaokoin）為具有雙環壬烷新骨架的新穎結構類型化合物；草果酮（tsaokone）為新的二苯庚烷類化合物；草果甙（tsaokoside）為新的半日花烷型二萜配糖體，并證明草果中的酚類物質具有較強的抗脂質過氧化作用。

圖6 不同飼料組小鼠肝組織和血漿中MDA及血漿中8-ISO-PGF2α含量的變化Fig.6 The content of MDA and 8-ISO-PGF2α in mice fed the control and experimental diets

在異常情況下，機體防御機制失衡，會導致自由基的大量產生，對機體產生毒害作用，從而導致機體的衰老和死亡[22]。國內外研究表明，多數香辛料具有較強的抗氧化性能，其主要的抗氧化成分為多酚類及其衍生物、黃酮類、豆香精類等。胡忠澤等[23]通過從姜黃屬植物提取出的姜黃素進行小鼠抗氧化研究，證明添加姜黃素的飼料具有升高小鼠血清和組織SOD活性及降低MDA含量的作用。李遠坤等[24]發現生姜的提取物姜油樹脂可以升高小鼠肝組織SOD活性，降低肝組織MDA含量。何文珊等[25]從生姜中分離出一種新的環狀二苯基庚烷類化合物亦可降低小鼠肝組織中MDA的含量。在本實驗結果中，由圖3和圖6（A）、圖6（B）可看出，與模型對照組比較，草果實驗組均能顯著降低小鼠血漿與肝組織中MDA含量，提高SOD活性，與上述研究結果一致。此外，與草果低劑量組相比，草果高劑量組可顯著提高血漿SOD活性，證明體內SOD活性與草果甲醇溶出物的攝取量有關。

GSH與GSH-Px均可衡量機體的抗氧化能力。張迪等[26]進行了熟地黃對慢性溫和性應激小鼠的抗氧化作用的研究，表明其具有提高小鼠肝組織GSH含量的作用。張元菊等[27]發現姜科植物姜黃的提取物姜黃素具有提高小鼠腦組織GSH-Px活性的作用。曹亞軍等[28]通過生姜醇提取物對亞急性衰老小鼠抗脂質過氧化作用的研究，證實該提取物能顯著提高衰老小鼠血清、肝臟及腦組織中的GSH-Px的活性。夏道宗等[29]從另一姜科植物提取出的高良姜素可提高小鼠腦組織與肝組織的GSH-Px活性。本實驗與上述研究結果相一致，由圖4、圖5可見，與模型對照組比較，草果實驗組可顯著提高小鼠血漿及肝組織中GSH含量及GSHPx活性。除肝組織GSH外，草果高劑量組與低劑量組之間均有統計學差異，說明草果甲醇溶出物的用量對體內GSH含量及GSH-Px活性均產生顯著的影響。

8-ISO-PGF2α被認為是反映自由基和脂質過氧化反應的特異性、可靠的指標[30]。師玲玲等[19]對心肌缺血大鼠的研究表明，急性心肌缺血時存在氧自由基損傷，8-ISO-PGF2α含量明顯增加。由圖6（C）可看出，與模型對照組相比，草果高劑量組能顯著降低血漿8-ISO-PGF2α的含量，表明草果甲醇溶出物能夠較好的抑制體內8-ISO-PGF2α含量增高。

綜上，姜黃、生姜等多種姜科植物均有很好的抗氧化活性，而同屬姜科植物的草果可能含有與其他姜科植物類似的功效成分，這些成分通過增強機體清除氧自由基的能力，減少體內自由基產生，進而保護細胞免受氧化損傷[31]。與模型對照組相比，草果實驗組能顯著提高血漿及肝組織GSH含量、SOD與GSH-Px活力，并能顯著降低MDA與8-ISO-PGF2α含量，說明草果甲醇提取物具有良好的抗衰老作用。與空白對照組相比，草果實驗組的血漿SOD活力和GSH含量亦有顯著提高，說明草果甲醇溶出物還能延緩正常小鼠的衰老進程，隨著這些結果進一步解明，草果的生理活性物質將可應于第三代保健食品的研究開發。

4 結論

本研究通過測定小鼠血漿及肝組織中SOD、GSHPx活力，血漿及肝組織中GSH、MDA含量，以及血漿中8-ISO-PGF2α含量來評價草果甲醇溶出物的抗氧化能力。本次實驗結果證明，體內SOD活性與草果甲醇溶出物的攝取量有關；草果甲醇溶出物的用量對體內GSH含量及GSH-Px活性均產生顯著的影響；草果甲醇溶出物能夠較好的抑制體內8-ISO-PGF2α含量增高。以上研究結果說明草果含有多種生理活性成分和作用，尤其是抗老化作用非常突出，但有關草果功效成分的構效、量效關系及作用機理研究，目前國內外還處于空白狀態，在今后的研究中應逐步得到解明。

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Study on mechanism of antioxidant effect of methanol extracts from tsao-ko（amomum tsao-ko crevost et lemaire）in aged mice induced by D-galactose

YAN Qian1，YU Long-quan2，*，CHEN Ye1，WANG Hong-tao3，ZHANG Qiu-yan3，WEI Gang3
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.School of Chemical Engineering，Shijiazhuang University，Shijiazhuang 050035，China；3.Yiling Medicinal Academy，Shijiazhuang 050035，China）

Objective：To investigate the antioxidant effect of bioactive substances from tsao-ko in the aged ICR mice induced by D-galactose.Methods：Aged mice induced by high fat diet and D-galactose were feeding separately with different kinds of diets.High dose of tsao-ko was 200mg/kg，low dose of tsao-ko was 100mg/kg. The level of SOD，GSH，GSH-Px，MDA and 8-ISO-PGF2α in plasma，liver was investigated in aged mice in the experiment of the antioxidant activity in vivo.Results：Compared with the control group about the data of plasma，the activity of SOD in the aged mice conducted with tsao-ko was significantly improved（p＜0.01），the content of GSH of mice deposed with tsao-ko was significantly improved（p＜0.01），the activity of GSH-Px in the aged mice conducted with high dose of tsao-ko was significantly improved（p＜0.01），the content of MDA in the aged mice conducted with tsao-ko was lower（p＜0.05），the content of 8-ISO-PGF2α in the aged mice conduced with high doses of tsao-ko was lower（p＜0.05）.Compared with the control group about the data of liver，the activity of SOD of mice conducted with low dose of tsao-ko was improved（p＜0.05）and significantly improved with high dose（p＜0.01），the content of GSH in the aged mice conducted with high dose of tsao-ko was significantly improved（p＜0.01），the activity of GSH-Px of mice conducted with tsao-ko was improved significantly（p＜0.01），the content of MDA in the aged mice conducted with tsao-ko was lower significantly（p＜0.01）.Conclusion：The methanol extract of tsao-ko could increase the level of SOD，GSH，GSH-Px and reduce MDA and 8-ISO-PGF2α.

tsao-ko；methanol extract；D-galactose；antioxidant effect；mice

TS201.4

A

1002-0306（2014）06-0351-07

2013－08－28 *通訊聯系人

閆倩（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品營養。