增殖誘導配體在多發性骨髓瘤中的表達及臨床意義

張桂華　陳令松　張秋榮等

[摘要] 目的 定量分析多發性骨髓瘤患者化療前后外周血單個核細胞和血漿中增殖誘導配體（APRIL）mRNA及蛋白的表達水平。方法 應用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）及實時熒光定量聚合酶鏈反應（RFQ-PCR）技術測定靶基因及靶蛋白的準確含量。 結果 MM患者化療前APRIL mRNA及蛋白表達水平均顯著高于正常對照（P<0.05）；化療前Ⅲ期APRIL mRNA及蛋白表達水平顯著高于Ⅰ期及Ⅱ期（P<0.05）；化療后PD組顯著高于CR及PR組（P<0.05）。 結論 APRIL可能參與MM的發生與發展并與腫瘤負荷量及療效密切相關， 其mRNA與蛋白表達水平相一致，且可能成為有效治療MM的新靶點。

[關鍵詞] 增殖誘導配體；多發性骨髓瘤；靶點；酶聯免疫吸附試驗

[中圖分類號] R733.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）04-0011-03

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種以骨髓中漿細胞惡性克隆性增殖為特征的B淋巴細胞惡性腫瘤，與骨髓基質細胞密切相關。其自分泌或旁分泌的可溶性細胞因子等瀑布式激活多發性骨髓瘤細胞胞內信號傳導途徑，同時可能增加的基質細胞分泌的細胞因子促進腫瘤細胞生成[1]。這些細胞因子中即包括增殖誘導配體（a proliferation-inducing ligand， APRIL），其為TNF家族新成員， 因具有促進腫瘤細胞增殖作用而命名，為幼稚、未成熟及活化B淋巴細胞的主要存活因子之一[2，3]。在多發性骨髓瘤細胞受外源性刺激激活的各種信號途徑中，NF-кB 途徑可能是最主要的途徑之一。目前研究已證實，能直接激活NF-кB途徑的APRIL，已經被確認是多發性骨髓瘤細胞的主要存活因子及生長因子，骨髓瘤細胞系及幼稚骨髓瘤細胞高表達APRIL及其體[1，4，5]。APRIL被發現具有保護MM、B-CLL細胞避免自發性凋亡及藥物誘導性凋亡作用，同時可提高其細胞存活能力[6]。故目前認為，對APRIL的研究極有可能成為腫瘤，尤其是B淋巴細胞惡性腫瘤研究的新方向。

本研究采用ELISA及RFQ-PCR技術，測定不同分期MM首次就診及應用一周期VAD方案化療后患者外周血血漿中APRIL蛋白及單個核細胞中APRIL mRNA的表達情況，并歸納總結APRIL表達與MM不同分期及化療前后間的關系，以期在MM早期診斷、早期治療、預測疾病活動以及尋找預后生物參數等方面發揮重要作用，并為臨床治療新方法提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

62份標本均取自徐州醫學院第二附屬醫院、南通大學附屬醫院、第二附屬醫院血液科2008年4月～2012年5月住院的31例初診及一周期VAD方案化療后患者外周血。其中男22例， 女9例，中位年齡65歲（46～82歲）。MM Ⅰ期6例，Ⅱ期9期，Ⅲ期16例，其中A組12例，B組19例。15份健康供者標本，中位年齡69歲（55～80歲）。MM分型、療效標準及疾病診斷采用《血液病診斷及療效標準》，由張之南主編。MM分期按國際分期系統（ISS）進行。

1.2 實驗材料

限制性內切酶、T4 DNA連接酶； pGEM-T載體試劑盒；Trizol 試劑；X-gal、Taq DNA聚合酶；逆轉錄試劑盒（Qiagen公司）；DL-2000；膠回收試劑盒；ELISA試劑盒、核酸蛋白紫外分析儀、熒光定量PCR儀、全自動酶標儀。

1.3 實驗方法

1.3.1制備標本 取化療前及后患者外周血6 mL，應用EDTA抗凝， 2 mL提取血漿，4 mL分離出單個核細胞。

1.3.2設計探針及引物 據注冊號為NM012512的β2微球蛋白（β2M） 全序列（內參）和APRIL （注冊號為AF04688 ），設計相應引物和熒光探針并合成。

1.3.3 構建增殖誘導配體（APRIL）及內參β2微球蛋白（β2M）標準品 細胞總RNA經Trizol法提取后檢測其濃度和純度，并進行逆轉錄反應， cDNA進行擴增目的片段，膠回收電泳PCR產物與T載體連接，連接產物經過藍白斑試驗篩選出重組質粒，提取出小量，陽性克隆經EcoRⅠ酶切鑒定、測序分析證實后進一步擴增，質粒抽提，再經核酸蛋白紫外分析儀定量，按倍比稀釋后保存。

1.3.4 RFQ-PCR檢測mRNA含量 在離心管中加入反應體系，并設5個APRIL或β2M標準品、空白管及陰性管各3個復孔作為對照。PCR 擴增在熒光定量檢測儀中進行。由電腦軟件計算出標本中β2M或APRIL mRNA值， 將APRIL與β2M mRNA比值定為評估APRIL mRNA表達水平的標值。

1.3.5 ELISA方法檢測APRIL蛋白含量 嚴格按照說明書執行，測定靶蛋白含量。

1.4 統計學處理

采用Stata7.0統計學軟件進行數據處理。數據以均數±標準差（x±s）表示，正常對照及MM患者化療前不同分期、MM患者化療后不同療效APRIL mRNA和蛋白的表達比較均采用單因素方差分析，如差異有統計學意義，進一步兩兩比較采用Scheffe法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 總RNA的純度和質量

細胞總RNA檢測表明，提示質量及完整性均良好。

2.2 PCR擴增產物電泳檢測

擴增產物經電泳檢測， 結果表明片段大小符合預期值。

2.3 鑒定陽性克隆

將藍白斑試驗篩選出的重組質粒， 抽提出小量，EcoRⅠ酶切鑒定陽性克隆后測序分析，顯示與β2M及APRIL的基因序列相符，同源性達100%（封三圖1）。

2.4 ELISA檢測的線性關系

APRIL標準品經酶標儀測定OD值，得出標準曲線，顯示不同標準品濃度與相應OD值之間存在良好的線性相關（r=1%）。

2.5 增殖誘導配體（APRIL）mRNA及蛋白測定結果（表1、2）

結果表明：對照組與MM患者化療前各期APRIL mRNA及蛋白表達均采用單因素方差分析比較有統計學差異（APRIL mRNA F=4.28，P=0.0275； APRIL蛋白F=5.11，P=0.0157），Scheffe法進一步兩兩比較顯示：各期mRNA及蛋白水平均顯著高于正常對照（P<0.05），且Ⅲ期APRIL mRNA及蛋白表達水平顯著高于Ⅰ、Ⅱ期（P<0.05）；化療后不同療效組APRIL mRNA及蛋白表達均采用單因素方差分析比較有統計學差異（APRIL mRNA F=7.53，P=0.0143；APRIL蛋白F=8.27，P=0.0126），Scheffe法進一步兩兩比較表明：CR及PR組mRNA及蛋白表達均顯著低于PD組（P<0.05）。

3 討論

在過去的幾年中，努力尋找識別MM高危人群的預后指標及明確促進MM細胞惡性增殖及耐藥發生的一系列復雜機制的研究已大量開展，最近研究顯示，APRIL在B細胞的生成、免疫耐受及惡性克隆性增殖等方面均發揮重要作用[6，7]。在正常生理狀態下，APRIL是骨髓中漿細胞不可缺少的生存因子[5]。研究顯示，分泌大量APRIL的巨核細胞[8]，對漿細胞而言是必不可少的骨髓組成部分，間接表明漿細胞存活有賴于APRIL[9]。這些選擇性局灶性分泌的APRIL可能對骨髓中淋巴系統惡性腫瘤的存活起至關重要的作用[10]。多項研究已證實APRIL在腫瘤疾病中發揮重要作用，尤其是B細胞惡性腫瘤[11，12]。人APRIL 轉染的小鼠，大約40%最終發展為類似于B-CLL的B1細胞惡性腫瘤[11]。

在我們的研究中發現，MM患者APRIL血清蛋白表達水平明顯高于正常對照，與文獻報道相一致[10，13]，且APRIL mRNA表達與蛋白水平表達一致。更重要的是，我們證實，MM分期越高，其APRIL mRNA及蛋白表達水平越高，Ⅲ期明顯高于Ⅰ期及Ⅱ期，化療后表達水平下降，與文獻報道相一致[10]，具體數據另篇文章詳細敘述。我們進一步將化療后不同療效進行比較發現，PD組顯著高于CR及PR組（P<0.05） ，與文獻報道相一致[10]。提示APRIL表達的變化存在于MM發生、發展的臨床全過程，可能參與MM的發生與發展并可反映MM腫瘤負荷量及療效，是輔助判斷MM緩解狀態的有用指標，其可能是MM的主要促瘤因子。研究顯示，化療前高表達APRIL患者無病生存期縮短[10]，表明APRIL可能成為判斷疾病預后的生物因子。研究證實，MM微環境中的破骨細胞通過旁分泌的方式產生大量的APRIL促進骨髓瘤的發生、發展[14]，其可能會成為MM及其他B細胞惡性腫瘤治療的新靶點。目前已有研究[15]采用抗APRIL抗體阻斷其與相應受體-BCMA及TACI相結合，以抑制其因APRIL誘導的增殖、存活作用。

總之，我們的結果已顯示，APRIL mRNA及蛋白水平表達可能是一個提示MM疾病活動和進展的有用的生物學指標。治療前APRIL表達水平可能成為提示MM無進展生存期的預測因子。APRIL水平檢測可以作為MM的提前診斷、早期治療及預后的新指標，且可能成為有效治療的新靶點。

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（收稿日期：2013-11-18）

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