耐性細(xì)菌的分離鑒定及重金屬污染修復(fù)初步研究

陳佳亮，劉曉文，張雅靜，方曉航*

耐性細(xì)菌的分離鑒定及重金屬污染修復(fù)初步研究

陳佳亮1,2，劉曉文2，張雅靜2，方曉航2*

1. 廣東省環(huán)境科學(xué)研究院，廣東 廣州 510045；2. 環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣東 廣州 510655

清遠(yuǎn)市是中國最大的電子廢棄物拆解基地之一，小作坊生產(chǎn)模式已經(jīng)進(jìn)行了20多年，大量無法回收的電子廢料和處理殘?jiān)缺粌A倒在田地、溝渠和山谷中，致使周邊土壤長期受到重金屬Cd、Cu、Pb污染。近年來國內(nèi)外對拆解區(qū)周邊的土壤重金屬污染現(xiàn)狀分析、健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)等相關(guān)報(bào)道較多，但針對電子廢棄物復(fù)合重金屬污染生物修復(fù)技術(shù)的研究卻并不多見。通過富集、馴化、分離，從清遠(yuǎn)市電子廢棄物拆解區(qū)污染土壤中得到4種耐性菌株，經(jīng)菌落形態(tài)、掃描電鏡分析以及16S rDNA技術(shù)鑒定得出，菌株HS-01、JH-02、YB-03、JY-04分別為海水芽孢八疊球菌（Sporosarcina aquimarina）、佐呂間湖生芽孢八疊球菌（Sporosarcina saromensis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。由生長特性實(shí)驗(yàn)得到，細(xì)菌HS-01與JY-04生長周期相同，在0～8 h為調(diào)整期，8～12 h為對數(shù)期，12～24 h為穩(wěn)定期，24～32 h為衰亡期。而細(xì)菌JH-02與YB-03生長周期相同，在0～4 h為調(diào)整期，4～12 h為對數(shù)期，12～24 h為穩(wěn)定期，24～32 h為衰亡期。細(xì)菌HS-01、JH-02、JY-04的最適溫度與pH分別為30 ℃和8，而YB-03則為35 ℃與7.5。生物吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著重金屬離子質(zhì)量濃度的升高，4種耐受細(xì)菌對重金屬離子的吸附量也逐漸升高，但吸附量增長率以及吸附率卻逐漸降低，這4種細(xì)菌對Cd2+、Cu2+、Pb2+最大吸附量分別達(dá)到了2.25、2.05、2.28、2.25 mg，8.19、4.95、8.53、11.78 mg和10.84、10.59、7.66、9.02 mg。最大吸附率則分別達(dá)到了94.4、99.2、100、93.3%，86.1、90.8、88.6、87.3%和88.9、82.2、81.2、86.7%。其中細(xì)菌HS-01、YB-03、JY-04吸附Cd2+能力較強(qiáng)，而細(xì)菌JY-04對Cu2+以及HS-01、JH-02對Pb2+吸附能力最強(qiáng)。上述結(jié)果顯示了4種耐性細(xì)菌均具有較好的修復(fù)復(fù)合重金屬污染水體的應(yīng)用潛力，但對于電子廢棄物復(fù)合重金屬污染土壤的修復(fù)機(jī)理和效率還有待進(jìn)一步研究。

電子廢棄物；土壤；耐性細(xì)菌；重金屬；復(fù)合污染修復(fù)

表1 土壤基本性質(zhì)Table 1 Basic properties of soils

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 土壤樣品

耐性細(xì)菌的篩選土壤采自廣東省清遠(yuǎn)市電子廢棄物拆解區(qū)周邊表層土壤（0～20 cm），土壤基本性質(zhì)與采樣點(diǎn)信息見表1。采用電位測定法（國家林業(yè)局，1999）測定土壤pH值，HNO3+HClO4+HF消解，火焰原子吸收光譜法（鮑士旦，2000；王春銘等，2013）測定土壤Cd、Cu、Pb全量；儀器使用火焰原子吸收分光光度儀（PerkinElmer PinAAcle 900T）。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）富集培養(yǎng)基（Tamer和Sibel，2006）：葡萄糖2 g，KH2PO43 g，(NH4)2SO4·7H2O 0.5 g，MgSO42 g，CaCl2·2H2O 0.25 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，NaCl 0.1 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0。2）固體培養(yǎng)基（Seulki等，2012）：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，瓊脂18 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0。3）生物吸附水溶液：富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入CdCl2·21/2H2O、CuSO4·5H2O、Pb(NO3)2試劑，使溶液Cd2+、Cu2+、Pb2+復(fù)合質(zhì)量濃度分別達(dá)到10、50、50 mg·L-1，20、100、100 mg·L-1與40、200、200 mg·L-13個(gè)梯度。

1.2方法

1.2.1 菌株的馴化分離

馴化分離方法參照（靳治國，2010）相關(guān)研究加以改進(jìn)。將5 g土壤樣品加入裝有100 mL無菌水的150 mL錐形瓶，150 r·min-1震蕩2 h后放置30 min，將富集培養(yǎng)基制備成Cd2+、Cu2+、Pb2+質(zhì)量濃度分別為10、100、100 mg·L-1的復(fù)合溶液，向150 mL錐形瓶中加入該溶液100 mL，將5 mL土壤上清液加入錐形瓶，在30 ℃下以150 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d，濁度增加后，取5 mL轉(zhuǎn)入新的復(fù)合溶液中，連續(xù)3次，然后增加復(fù)合溶液Cd2+、Cu2+、Pb2+的質(zhì)量濃度至100、1000、1000 mg·L-1，重復(fù)上述步驟，將所得菌液稀釋104～108倍后均勻涂布到固體培養(yǎng)基上，待長出菌落后，挑取生長豐滿的單菌落，劃線獲得純培養(yǎng)。

1.2.2 菌株的鑒定

1）PCR擴(kuò)增：細(xì)菌引物為大腸桿菌27F（5′-AGATTTGATCMTGGCTCAG-3′）與1492R (5′-TACGGYTACCTTGTTACGAC TT-3′)，在PCR儀（Takara TP600）中進(jìn)行。2）電泳：對反應(yīng)后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，PCR產(chǎn)物上樣量為3 μL。3）DNA測序：對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源性比對，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知菌株的序列進(jìn)行比較，相似度最高的即為該菌株的菌種名。

1.2.3 掃描電鏡分析

微生物樣品制備方法參考（梁靜南等，2013）相關(guān)研究，用導(dǎo)電膠將樣品固定于樣品臺上，置于自動涂料器（JCF-1600）中進(jìn)行真空鍍金處理后，用SEM掃描電鏡（JEOL JSM-6510LV）在15KV加速電壓下觀察，保存不同放大倍數(shù)下的掃描電鏡照片。

1.2.4 生長特性研究

生長曲線、溫度影響、pH影響的測定方法在相關(guān)研究基礎(chǔ)上加以改進(jìn)（張璐，2009）。1）生長曲線：將篩選得到的菌株接種于富集培養(yǎng)基中活化24 h，取2 mL加入盛有100 mL富集培養(yǎng)基的150 mL錐形瓶中，30 ℃下?lián)u床150 r·min-1震蕩培養(yǎng)，選擇600 nm的波長，每4 h用分光光度計(jì)（Spectrumlab 752sp）測定菌液的OD600值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)菌生長曲線，以未接種的富集培養(yǎng)基作空白對照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。2）溫度影響：將菌株活化24 h，取2 mL加入100 mL富集培養(yǎng)基中，溫度設(shè)置為10、20、25、30、35、40、50 ℃，150 r·min-1震蕩培養(yǎng)24 h，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分光光度計(jì)比色法測定菌液的OD600值。3）pH影響：將菌株活化24 h，取2 mL加入100 mL富集培養(yǎng)基中，用1 mol·L-1的HCl和NaOH準(zhǔn)確調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為4、6、6.5、7、7.5、8、10，于30 ℃搖床150 r·min-1震蕩培養(yǎng)24 h，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分光光度計(jì)比色法測定菌液的OD600值。

1.2.5 生物吸附特性研究

取2 mL菌液加入100 mL富集培養(yǎng)基，在30 ℃下150 r·min-1震蕩培養(yǎng)24 h，記錄菌液OD600值，離心后將菌體加入100 mL含Cd2+、Cu2+、Pb2+質(zhì)量濃度分別為10、50、50 mg·L-1，20、100、100 mg·L-1與40、200、200 mg·L-13個(gè)梯度的復(fù)合溶液。150 mL錐形瓶中30 ℃下150 r·min-1震蕩培養(yǎng)2 h，離心過濾后測定清液中重金屬質(zhì)量濃度，以未接種的復(fù)合溶液作空白對照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。細(xì)菌對重金屬離子吸附率除計(jì)算公式為：β=(ρ0?ρe )/ρ0×100%。式中：ρ0為溶液中重金屬離子的初始質(zhì)量濃度，mg·L-1；ρe為吸附反應(yīng)后溶液中重金屬離子質(zhì)量濃度，mg·L-1。

2 結(jié)果與討論

2.1菌株的分離

對采自清遠(yuǎn)市電子廢棄物拆解區(qū)周邊污染土樣中的微生物進(jìn)行富集、馴化、分離。依據(jù)菌落形態(tài)、大小和顏色等特征，最終從6個(gè)土壤樣品中篩選出4種菌株，其中將土壤樣品1-1中分離得到的2種菌株命名為HS-01、JH-02、將土壤樣品2-1中分離得到的2種菌株命名為YB-03、JY-04。

2.2掃描電鏡分析

分析平板菌落形態(tài)（李振高等，2008）并結(jié)合掃描電鏡分析（圖1）得到：HS-01菌落呈不規(guī)則狀，表面隆起有光澤，邊緣波狀，黃色濕潤不透明，菌體呈球形和卵圓形，直徑約為0.4～1 μm，周長約為0.6～1.2 μm；JH-02菌落呈假根狀，表面扁平無光澤，邊緣裂片狀，白色干燥不透明，菌體呈球桿狀，直徑約為0.4～0.6 μm，周長約為0.8～1.2 μm；YB-03菌落呈點(diǎn)狀，表面隆起有光澤，邊緣完整，淡黃色濕潤半透明，菌體呈球桿狀，直徑約為0.4～0.8 μm，周長約為0.6～1 μm；JY-04菌落呈不規(guī)則狀，表面乳突有光澤，邊緣波狀，白色濕潤半透明，菌體呈桿狀和球桿狀，直徑約為0.6～1.2 μm，周長約為1.2～1.8 μm。

2.3菌株的鑒定

經(jīng)PCR擴(kuò)增出的4種產(chǎn)物大小均為1500 bP(圖 2)，Blast同源性比對結(jié)果顯示，菌株HS-01與Sporosarcina aquimarina strain KUDC1821同源性達(dá)到100%；JH-02與Sporosarcina saromensis strain KUDC1822同源性最高，達(dá)到98%；YB-03與Bacillus megaterium strain JN34同源性最高，達(dá)到了99%；JY-04與Bacillus methylotrophicus strain PY5同源性達(dá)到100%。結(jié)合平板菌落呈形態(tài)和掃描電鏡分析結(jié)果得出，4株菌株HS-01、JH-02、YB-03、JY-04分別為海水芽孢八疊球菌（Sporosarcina aquimarina）、佐呂間湖生芽孢八疊球菌（Sporosarcina saromensis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

圖1 細(xì)菌掃描電鏡圖Fig. 1 SEM images of bacteria

圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 PCR produets of electrophoresis

圖3 細(xì)菌生長曲線Fig. 3 Growth curves of bacteria

2.4生長特性研究

4種耐性細(xì)菌生長曲線如圖3所示，細(xì)菌HS-01與JY-04生長周期相同，在0～8 h為調(diào)整期，8～12 h為對數(shù)期，12～24 h為穩(wěn)定期，24～32 h為衰亡期；而細(xì)菌JH-02與YB-03生長周期相同，在0～4 h為調(diào)整期，4～12 h為對數(shù)期，12～24 h為穩(wěn)定期，24～32

h為衰亡期。細(xì)菌接種量與營養(yǎng)物質(zhì)含量一定的情況下，調(diào)整期時(shí)間長短與細(xì)菌適應(yīng)能力有關(guān)（周艾平，2011）。細(xì)菌JH-02與YB-03調(diào)整期時(shí)間較短，相比于HS-01與JY-04適應(yīng)性更強(qiáng)。另外，細(xì)菌YB-03與JY-04菌液OD600最大值分別達(dá)到1.760、1.679，高于細(xì)菌HS-01與JH-02的0.801、0.671。

圖4 溫度與pH對細(xì)菌生長的影響Fig. 4 Effect of temperature and pH on growth of bacteria

溫度與pH影響實(shí)驗(yàn)顯示（圖4），在溫度過低（10 ℃）與過高（50 ℃）環(huán)境下，4種細(xì)菌的OD600值顯著下降，其中細(xì)菌HS-01、JH-02在40 ℃時(shí)OD600值已顯著下降，說明該環(huán)境不適宜菌株生長繁殖，細(xì)菌在20～35 ℃之間生長相對穩(wěn)定，這與王倩倩對紅酵母菌（Rhodotorula sp.）的研究結(jié)果相似（王倩倩，2008）；在強(qiáng)酸性（pH=4）與強(qiáng)堿性（pH=10）環(huán)境下，4種細(xì)菌OD600值顯著下降，其中細(xì)菌HS-01、YB-03、JY-04在pH=6時(shí)OD600值已顯著下降，生長繁殖受到極強(qiáng)的抑制作用，所以細(xì)菌的pH適宜范圍應(yīng)為6.5～8。綜上得出，HS-01、JH-02、JY-04的最適溫度為30 ℃，最適pH為8，YB-03則為35 ℃與7.5。

2.5生物吸附特性研究

研究結(jié)果如表2所示，隨著重金屬離子質(zhì)量濃度的升高，4種細(xì)菌對重金屬離子吸附量也逐漸升高，但吸附量增長率卻逐漸降低。這可能與菌體吸附位點(diǎn)飽和度有關(guān)，當(dāng)重金屬離子質(zhì)量濃度較高時(shí)，只有部分離子能夠與吸附位點(diǎn)作用，且高質(zhì)量濃度的重金屬離子對菌體的吸附結(jié)構(gòu)也有影響（周薇，2009；陳月芳等，2013）。當(dāng)Cd2+、Cu2+、Pb2+復(fù)合質(zhì)量濃度分別達(dá)到40、200、200 mg·L-1時(shí)，此時(shí)細(xì)菌仍能繼續(xù)吸附重金屬離子，但菌體吸附位點(diǎn)已逐漸趨近于飽和。細(xì)菌HS-01、JH-02、YB-03、JY-04對Cd2+、Cu2+、Pb2+最大吸附量分別達(dá)到了2.25、2.05、2.28、2.25 mg，8.19、4.95、8.53、11.78 mg和10.84、10.59、7.66、9.02 mg，同等條件下普遍高于其他相關(guān)研究結(jié)果（王倩倩，2008；周薇，2009；劉麗，2010；Fan等，2011）。除Cu2+質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg·L-1時(shí)，細(xì)菌JH-02與YB-03對Cu2+的吸附量低于質(zhì)量濃度為50、100 mg·L-1之外，其余各組吸附量均隨著重金屬質(zhì)量濃度上升而增大，出現(xiàn)這種情況可能是因?yàn)楫?dāng)Cu2+質(zhì)量濃度較高時(shí)（200 mg·L-1），超過了細(xì)菌JH-02與YB-03對Cu2+的耐受范圍，此時(shí)Cu2+已對這2種細(xì)菌產(chǎn)生了一定程度的毒害效應(yīng)，從而導(dǎo)致2種細(xì)菌活體數(shù)量以及菌體活性大幅下降，進(jìn)而影響其對Cu2+的吸附量。

表2 細(xì)菌吸附量Table 2 Adsorption amounts of bacteria mg

由細(xì)菌吸附率計(jì)算結(jié)果得出（圖5），在Cd2+（10、20 mg·L-1）、Cu2+（50、100 mg·L-1）、Pb2+（50、100 mg·L-1）質(zhì)量濃度較低時(shí)，4種細(xì)菌都表現(xiàn)出較好的吸附效率，其中細(xì)菌HS-01、JH-02、YB-03、JY-04對Cd2+、Cu2+、Pb2+最大吸附率分別達(dá)到了94.4、99.2、100、93.3%，86.1、90.8、88.6、87.3%和88.9、82.2、81.2、86.7%。在同等條件下均高于其他研究中微生物對單一以及復(fù)合重金屬離子的吸附率（馮宏等，2013；劉麗，2010；王倩倩，2008；周薇，2009）。隨著重金屬離子質(zhì)量濃度的逐漸升高，除了細(xì)菌YB-03在Cd2+質(zhì)量濃度從10 mg·L-1上升至20 mg·L-1以及Cu2+質(zhì)量濃度從50 mg·L-1上升至100 mg·L-1時(shí)，細(xì)菌對重金屬的吸附率下降不顯著外，其余各組中吸附率普遍呈顯著下降趨勢。而當(dāng)Cd2+質(zhì)量濃度上升至40 mg·L-1以及Cu2+質(zhì)量濃度上升至200 mg·L-1時(shí)，細(xì)菌YB-03的吸附率顯著低于其他各組，這可能是由于當(dāng)Cd2+質(zhì)量濃度范圍為10～20 mg·L-1以及Cu2+質(zhì)量濃度范圍為50～100 mg·L-1時(shí)，細(xì)菌YB-03活性較強(qiáng)，但隨著

Cd2+質(zhì)量濃度上升至40 mg·L-1以及Cu2+質(zhì)量濃度上升至200 mg·L-1時(shí)，由于Cd2+、Cu2+生物毒性較強(qiáng)，細(xì)菌YB-03活性大幅下降，從而導(dǎo)致其對重金屬的吸附率顯著下降（P＜0.05）。

圖5 復(fù)合重金屬不同質(zhì)量濃度下細(xì)菌的吸附率Fig.5 Adsorption ratios of bacteria under different combined heavy metals mass concentration

綜上得出，4種細(xì)菌均具有較好的吸附水體中重金屬離子的能力，其中細(xì)菌HS-01、YB-03、JY-04吸附Cd2+能力較強(qiáng)，而細(xì)菌JY-04對Cu2+以及HS-01、JH-02對Pb2+吸附能力最強(qiáng)。另外，在本次生物吸附研究中，4種細(xì)菌HS-01、JH-02、YB-03、JY-04菌液吸光度均值分別為0.781、0.698、1.712、1.644，雖然細(xì)菌HS-01、JH-02的菌液吸光度較低，但在不同重金屬離子質(zhì)量濃度下，2種細(xì)菌的吸附率與YB-03、JY-04相差不大，如經(jīng)過進(jìn)一步富集擴(kuò)大化培養(yǎng)之后，對重金屬離子的吸附潛力可能較大。

3 結(jié)論

1）4種分離自清遠(yuǎn)市電子廢棄物拆解區(qū)污染土壤的菌株，經(jīng)分析鑒定菌株HS-01、JH-02、YB-03、JY-04分別為海水芽孢八疊球菌（Sporosarcina aquimarina）、佐呂間湖生芽孢八疊球菌（Sporosarcina saromensis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

2）細(xì)菌HS-01與JY-04生長周期相同，在0～8 h為調(diào)整期，8～12 h為對數(shù)期，12～24 h為穩(wěn)定期，24～32 h衰亡期；而細(xì)菌JH-02與YB-03生長周期相同，在0～4 h為調(diào)整期，4～12 h為對數(shù)期，12～24 h為穩(wěn)定期，24～32 h衰亡期。HS-01、JH-02、JY-04的最適溫度與pH分別為30 ℃與8，而YB-03則為35 ℃與7.5。

3）在Cd2+、Cu2+、Pb2+質(zhì)量濃度分別為10、50、50 mg·L-1，20、100、100 mg·L-1與40、200、200 mg·L-13個(gè)梯度的復(fù)合溶液中，隨著重金屬離子質(zhì)量濃度的升高，4種耐受細(xì)菌對重金屬離子的吸附量逐漸升高，但吸附量增長率以及吸附率卻逐漸降低。對Cd2+、Cu2+、Pb2+最大吸附量分別達(dá)到了2.25、2.05、2.28、2.25 mg，8.19、4.95、8.53、11.78 mg和10.84、10.59、7.66、9.02 mg。另外，在Cd2+（10、20 mg·L-1）、Cu2+（50、100 mg·L-1）、Pb2+（50、100 mg·L-1）質(zhì)量濃度較低時(shí)，4種細(xì)菌都表現(xiàn)出較高的吸附率，對Cd2+、Cu2+、Pb2+最大吸附率分別達(dá)到了94.4、99.2、100、93.3%，86.1、90.8、88.6、87.3%和88.9、82.2、81.2、86.7%。4種耐性細(xì)菌均顯示出了較好的修復(fù)復(fù)合重金屬污染水體的應(yīng)用潛力，但對于電子廢棄物復(fù)合重金屬污染土壤的修復(fù)機(jī)理和效率還有待進(jìn)一步研究。

CHUNFA Wu, YONGMING Luo, SHAOPO Deng, et al. 2014. Spatial characteristics of cadmium in topsoils in a typical e-waste recycling area in southeast China and its potential threat to shallow groundwater[J]. Science of the Total Environment, (472):556-561.

LIANMEI Fan, ZHANQIANG Ma, JIANQIANG Liang, et al. 2011. Characterization of a copper-resistant symbiotic bacterium isolated from Medicago lupulina growing in mine tailings[J]. Bioresource Technology, (102): 703-709.

SEULKI J, HEE S M, KYOUNGPHILE N, et al. 2012. Application of phosphate-solubilizing bacteria for enhancing bioavailability and phytoextraction of cadmium (Cd) from polluted soil[J]. Chemosphere, (88): 204-210.

TAMER A, SIBEL T. 2006. Biosorption characteristics of Aspergillus flavus

biomass for removal of Pb(II) and Cu(II) ions from an aqueous solution[J]. Bioresource Technology, (97):1780-1787.

WEIHUA Zhang, YINGXIN Wu, SIMONNOT M O. 2012. Soil Contamination due to E-Waste Disposal and Recycling Activities: A Review with Special Focus on China[J]. Soil Science Society of China, 22(4): 434-455.

WENQING Ni, YAOWEN Chen, YUE Huang, et al. 2014. Hair mercury concentrations and associated factors in an electronic waste recycling area, Guiyu, China[J]. Environmental Research, (128):84-91.

鮑士旦. 2000. 土壤農(nóng)化分析[M]. 3版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社.

陳月芳,高琨,林海,等. 2013. 耐鉛鋅微生物對礦山酸性廢水中Zn2+和Pb2+吸附性能分析[J]. 中南大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 44(4): 1741-1746.

馮宏,李永濤,張干,等. 2013. 強(qiáng)抗鎘真菌月狀旋孢腔菌對重金屬的吸附作用[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 19(4):694-698.

國家林業(yè)局. 1999. 森林土壤pH值的測定LY/T 1239—1999[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社.

靳治國. 2010. 耐鉛錫菌株的篩選及其在污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用[D]. 重慶: 西南大學(xué): 19-25.

李振高,駱永明,滕應(yīng). 2008. 土壤與環(huán)境微生物研究法[M]. 北京: 科學(xué)出版社: 143-210.

梁靜南,劉一葦,謝家儀. 2013. 制備細(xì)菌類單細(xì)胞生物掃描電鏡樣品方法的改進(jìn)[J]. 電子顯微學(xué)報(bào), 32(3):276-278.

林文杰,吳榮華,鄭澤純,等. 2011. 貴嶼電子垃圾處理對河流底泥及土壤重金屬污染[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 20(1):160-163.

劉麗. 2010. 耐Cu、Cd微生物的分離篩選及其吸附機(jī)理研究[D]. 合肥:合肥工業(yè)大學(xué): 33-40.

羅巧玉,王曉娟,林雙雙,等．2013. AM真菌對重金屬污染土壤生物修復(fù)的應(yīng)用與機(jī)理[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 33(13): 3898-3906．

王春銘,高云華,張登偉,等. 2013. 廣州增城市垃圾填埋場封場土壤及植物重金屬調(diào)查與評價(jià)[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 32(4):714-720.

王倩倩. 2008. 耐受重金屬微生物的分離及其吸附Zn2+、Cd2+和Cr(VI)作用研究[D]. 沈陽: 東北大學(xué): 23-30.

袁劍剛,鄭晶,陳森林,等. 2013. 中國電子廢物處理處置典型地區(qū)污染調(diào)查及環(huán)境、生態(tài)和健康風(fēng)險(xiǎn)研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 8(4): 473-486.

張朝陽,彭平安,劉承帥,等. 2012. 華南電子垃圾回收區(qū)農(nóng)田土壤重金屬污染及其化學(xué)形態(tài)分布[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 21(10):1742-1748.

張璐. 2009. 微生物強(qiáng)化重金屬污染土壤植物修復(fù)的研究[D]. 長沙: 湖南大學(xué):34-38.

周艾平. 2011. 酵母融合菌的發(fā)酵培養(yǎng)及其對含鉻廢水的吸附處理[D].廣州: 暨南大學(xué): 22-32.

周薇. 2009. 耐鉛鋅微生物的篩選及吸附性能的研究[D]. 雅安: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué): 24-31.

Isolation and Identification of Four Tolerance Bacteria and the Preliminary Study for Pollution Remediation of Heavy Metals

CHEN Jialiang1,2, LIU Xiaowen2, ZHANG Yajing2, FANG Xiaohang2*
1. Guangdong Provincial Academy of Environmental Science, Guangzhou 510045, China; 2. South China Institute of Environmental science. MEP, Guangzhou 510655, China

Qing Yuan is one of the biggest electronic wastes dismantling base in China, the production pattern of individual workshop has been going on for more than 20 years. A large number of electronic wastes and treatment residuals were dumped in croplands, ditches and valleys. It made the surrounding soils polluted for a long time by Cd, Cu and Pb. There had lots of researches about the present situation analysis and health risk evaluation for heavy metals contaminated soil surrounding dismantling area. But there still had less reports on the study of bioremediation technologies for the e-waste pollution by combined heavy metals. Four tolerance bacteria was isolated from contaminated soil of e-waste dismantling area of qingyuan by this means of enrichment, domestication and isolation. The tolerance bacteria were identified by analyzed of colony morphology and scanning electron microscope and 16S rDNA technology. Four strains of HS-01, JH-02, YB-03 and JY-04 were respectively Sporosarcina aquimarina, Sporosarcina saromensis, Bacillus megaterium and Bacillus methylotrophicus. The growth characteristic experiments indicated that the bacteria of HS-01 and JY-04 had same growth cycle, the regulatory phase was 0-8 h, 8-12 h was the logarithmic phase, 12-24 h was stable phase and 24-32 h was decline phase; Bacterial JH-02 and YB-03 had same growth cycle, regulatory phase was 0-4 h, 4-12 h was logarithmic phase, 12-24 h was stable phase, and 24-32 h was decline phase. The optimum temperature and pH of HS-01, JH-02 and JY-04 was 30 ℃ and 8, while YB-03 was 35 ℃ and 7.5 respectively. With the increase of mass concentration of heavy metal ions, biosorption experiments showed that the adsorption amounts of four tolerance bacteria to heavy metal ions gradually increased, but the growth ratios of adsorption amounts and adsorption ratios were gradually decreased. The maximum adsorption amounts of four tolerance bacteria to Cd2+, Cu2+, Pb2+were 2.25, 2.05, 2.28, 2.25 mg，8.19, 4.95, 8.53, 11.78 mg and 10.84, 10.59, 7.66, 9.02 mg respectively. And the maximum adsorption ratios were 94.4, 99.2, 100, 93.3%, 86.1, 90.8, 88.6, 87.3% and 88.9, 82.2, 81.2, 86.7% respectively. The bacteria of HS-01, YB-03, JY-04 had better adsorption efficiency to Cd2+, JY-04 was optimal to Cu2+, and HS-01, JH-02 was the best to Pb2+. The above results suggests the potential application of four tolerance bacteria to remediate the polluted solution by combined heavy metals, but the remediation mechanism and efficiency of the e-waste polluted soils by combined heavy metals still need to be further research.

electronic wastes; soils; tolerance bacteria; heavy metal; combined pollution remediation

X172

A

1674-5906（2014）07-1199-06

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)（206030201-21）

陳佳亮（1987年生），男，碩士，主要從事重金屬污染生物修復(fù)研究。E-mail：chenjialiang_email@163.com

*通信作者：方曉航，高級工程師，主要從事水土污染環(huán)境修復(fù)研究。E-mail：fangxiaohang@scies.org

2014-03-20

陳佳亮，劉曉文，張雅靜，方曉航. 耐性細(xì)菌的分離鑒定及重金屬污染修復(fù)初步研究[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2014, 23(7): 1199-1204.

CHEN Jialiang, LIU Xiaowen, ZHANG Yajing, FANG Xiaohang. Isolation and Identification of Four Tolerance Bacteria and the Preliminary Study for Pollution Remediation of Heavy Metals [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(7): 1199-1204.

隨著電子信息化產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展與更新?lián)Q代，電子廢棄物污染正在全球范圍內(nèi)不斷擴(kuò)大，大量電子廢棄物和處理殘?jiān)诓鸾鈪^(qū)周邊露天堆置，導(dǎo)致周邊水體、土壤長期受到復(fù)合重金屬污染，嚴(yán)重威脅到人類生存健康（Wu等，2014；Ni等，2014；張朝陽等，2012）。并且重金屬常常會出現(xiàn)復(fù)合污染狀況，通過水稻進(jìn)入人類食物鏈，在電子廢棄物拆解區(qū)周邊人群的血液、胚胎、頭發(fā)中都能檢測到污染物的存在（Zhang等，2012）。汕頭市貴嶼鎮(zhèn)電子拆解區(qū)周邊河流底泥和土壤中的Cd、Cr、Cu、Pb均超過GB 15618—1995《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》二級標(biāo)準(zhǔn)，其中以Cd和Cu污染最為嚴(yán)重（林文杰等，2011）。清遠(yuǎn)市龍?zhí)痢⑹堑貐^(qū)重金屬污染最嚴(yán)重的土壤樣品中Cd、Pb、Cu、Zn、Ni和Cr質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別高達(dá)338、24011、50073、21224、2624和139 mg·kg-1，其他污染區(qū)的重金屬含量也達(dá)到了對照區(qū)的數(shù)倍甚至數(shù)十倍（袁劍剛等，2013）。近年來，國內(nèi)外學(xué)者已開始重視電子廢棄物拆解區(qū)周邊重金屬的污染，但目前針對電子廢棄物復(fù)合重金屬污染生物修復(fù)技術(shù)的研究卻并不多見。而微生物種類繁多，數(shù)量極大，分布廣泛，繁殖迅速，個(gè)體微小，比表面積大，對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，使得生物修復(fù)技術(shù)具有高效低耗、方便簡潔、保持水土等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)引起國內(nèi)外環(huán)境學(xué)者的廣泛關(guān)注（馮宏等，2013；羅巧玉等，2013）。本研究從清遠(yuǎn)市電子廢棄物拆解區(qū)周邊污染土壤中分離得到4種耐受細(xì)菌，在分析其生長特性的基礎(chǔ)上，利用4種耐受細(xì)菌處理Cd、Cu、Pb復(fù)合污染溶液，旨在對利用生

物技術(shù)修復(fù)電子廢棄物拆解區(qū)周邊重金屬污染水體與土壤提供參考和依據(jù)。