PCR（FQ-PCR）檢查在肺結核診斷中的臨床價值

韋毅支 成斌 孫桂蘭 匡中國

貴州省興義市人民醫院感染性疾病科，貴州興義562400

PCR（FQ-PCR）檢查在肺結核診斷中的臨床價值

韋毅支 成斌 孫桂蘭 匡中國

貴州省興義市人民醫院感染性疾病科，貴州興義562400

目的了解實時動態熒光定量PCR（FQ-PCR）監測在肺結核診斷中的臨床價值。方法采用前瞻性的方法用熒光定量PCR(FQ-PCR)技術對繼發性肺結核患者的痰和結核性胸膜炎患者的胸水作DNA(TB-DNA)定量監測，同時對非肺結核患者的痰作DNA(TB-DNA)定量監測。結果繼發型肺結核147例，痰涂片陽性率為21.09%，痰TB-DNA陽性例次率為36.73%；痰涂片抗酸染色陽性例次率為15.04%；在痰涂片TB陽性34例次中，痰菌TB-DNA陽性例次率為23.53%。在痰涂TB陰性的192例次中，TB-DNA陽性例次率為39.06%。結核性膜炎胸水檢查TB-DNA108例次，陽性例次率為12.03%；非肺結核患者112例。假陰性率為70.21%，假陽性率為9.60%，靈敏度為29.8%，特異度為90.3%。結論熒光定量PCR(FQ-PCR)TBDNA監測結果與國內報到不一致，其假陰性高，假陽性亦高，靈敏度低，特異度亦不高，且痰涂片抗酸桿菌陽性病人的痰TB-DNA陽性例次率亦低，對臨床診斷幫助不大，不作為疑似肺結核病人的常規檢查。

時動態熒光定量；肺結核；靈敏度；特異度

肺結核發病率呈逐年遞增趨勢，由于抗菌藥物的不合理使用及不規則治療，使結核桿菌產生耐藥菌株而致多重耐藥或耐多藥結核菌產生，給臨床治愈肺結核帶來了極大困難。痰涂片抗酸染色查到結核抗酸桿菌和痰結核菌培養出結核分枝桿菌是臨床確診肺結核并與其他肺部疾病鑒別的重要依據。近年來作為直接檢測分支桿菌、種系鑒定和藥敏試驗的許多分子學方法得到了長足發展，大大提高了結核的檢出率，其中，實時動態熒光定量PCR（FQPCR）因其技術成熟具有較高的靈敏度和特異性，已逐漸應用于臨床，為了解其在肺結核診斷中的臨床價值，對2012年3月—2013年12月之間在我院住院的肺結核病人和非肺結核病人進行痰或胸水PCR（FQ-PCR）檢測TB-DNA結果與傳統的痰涂片或胸水涂片查抗酸桿菌的方法進行比較，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用前瞻性的方法用熒光定量PCR(FQ-PCR)技術檢測肺結核患者238例，其中男性155例，女性83例，年齡10～82歲，診斷為繼發型肺結核147例，結核性胸膜炎91例。送檢痰標本147例，胸水91例。非肺結核患者112例。痰標本作結核分枝桿菌DNA (TB-DNA)定量，同時進行痰抗酸染色檢查；胸水作結核分枝桿菌DNA(TB-DNA)定量，同時進行胸水抗酸染色檢查。對非肺結核患者的痰液作結核分枝桿菌DNA(TB-DNA)定量作對照，以臨床診斷結果為金標準,分別計算TB-DNA、抗酸染色檢查的靈敏度、特異性和準確度，對兩組結果進行比較，以了解其在臨床診斷中的價值。

1.2 材料與試劑

檢測儀器為廣州達安DA-7600型檢測系統。試劑亦為廣州達安生產的結核分枝桿菌核酸檢驗試劑盒（PCR—熒光法）。

1.3 檢驗方法

1.3.1 DNA提取（1）陰性質控品處理。提取陰性質控品，8，000rpm離心數秒，吸50～0.5mL滅菌離心管中，加入50uL DNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理（10±1）min；12，000rpm離心5 min，備用。

（2）痰或胸水處理。①向玻璃管中加入4倍體積的4%NaOH，搖勻，室溫放置15～30 min待液化；②取液化后標本1.0～1.5 mL離心管，12，000rpm離心5 min；③去上清，沉淀加滅菌生理鹽水1 mL混勻，12，000 min離心5 min，如此兩次。去上清，沉淀加入50 uL DNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理（10±1）min；12，000rpm離心5 min，備用。

1.3.2 PCR擴增PE GeneAmp5700操作。

（1）試劑準備：按比例（TB—PCR反應液40 uL/人份+Taq酶/人份）取相應的PCR反應液及Taq酶，充分混勻后按43 uL/管分裝至0.2mL離心管中，備用。

（2）加樣：向準備好試劑的0.2 mL離心管中，分別加入處理后的樣品（包括標本、陰性質控品、臨界陽性質控品和強陽性質控品）上清液2 uL，或直接加入陽性定量參考品2 uL，8，000rpm離心數秒，放入儀器樣品槽。

（3）編輯。①按對應順序設置陰性質控品、陽性定量參考品以及未知標本（含臨界陽性質控品和強陽性質控品），并在name欄中設置樣品名稱。選中所有設置樣品孔，點擊工具欄中P鍵，選擇Prl Primerl后關閉窗口。②打開instrument窗口設置循環條件：93℃2 min，然后按93℃45s→55℃60s→10個循環，再93℃30s→55℃45s→30個循環。保存文件，運行。

（4）結果分析。①反應結束后保存檢測數據文件。②分析條件設置：根據分析圖像調節Baseline的start值、stop值以及Threshold的Valve值。使Std curve窗口下的標準曲線圖達到最佳，即correlation數值介于-1.0～-0.97。在Analyze自動分析結果。③到Tray窗口記錄未知標本數值（C）。“C”表示樣品的濃度和含量。

1.3.3 質量控制陰性質控品：增長的曲線不呈S型曲線或Ct值= 30；陽性質控品：增長曲線呈S型曲線，且強陽性質控品定量參考值在1×106基因拷貝/mL～2.0×107基因拷貝/mL范圍，臨界陽性質控品定量參考值在2×102基因拷貝/mL～2.0×104基因拷貝/mL范圍；以上要示需在同一次實驗中同時滿足，否則本次實驗無效，需從新進行。

表1 238例肺結核痰及胸水兩種方法檢測結果

1.4 統計分析

采用EXCEL 2003軟件進行統計分析，計數資料以率表示。

2 結果

繼發型肺結核147例，31例痰涂片抗酸染色找結核分枝桿菌陽性。痰涂片陽性率為21.09%，繼發型肺結核痰TB-DNA檢查例次226例次，TB-DNA陽性83例次，陽性例次率為36.73%；痰涂片TB陽性34例次，痰涂片抗酸染色陽性例次率為15.04%；在痰涂片TB陽性34例次中TB-DNA檢查陽性例次為8例次，痰菌陽性TB-DNA陽性例次率為23.53%。在痰涂TB陰性的192例次中，TB-DNA陽性例次為75例次，TB-DNA陽性例次率為39.06%。結核性膜炎胸水檢查TB-DNA108例次，陽性13例次，陰性95例次，陽性例次率為12.03%。非肺結核患者112例，查痰TB-DNA 124例次，TB-DNA陽性12例次，假陰性率為70.21%，假陽性率為9.60%。靈敏度為29.8%，特異度為90.3%。具體見表1和表2。

表2 FQ-PCR TB DNA檢測結果

3 討論

痰涂片抗酸染色查到結核抗酸桿菌和痰結核菌培養出結核抗酸桿菌仍是確診肺結核的重要依據，痰涂片抗酸染色法簡單、快速、經濟，但敏感性差，不能將結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌區別開來，其診斷的特異性低。隨著分子生學的快速發展，熒光PCR（FQ-PCR）技術把核酸擴增、雜交和光譜技術結合在一起，在封閉狀態下檢測，避免了擴增產物污染而出現假陽性，利用特異性探針，實時檢測，與自動分析一體化，實現了精確、特異、簡便、快速的檢測。我院肺結核147例肺結核痰涂片陽性檢出率為21.09%，痰菌熒光定量PCR法的陽性檢出例次率為36.73%，痰菌熒光定量PCR法的陽性檢出例次率明顯高于痰涂片抗酸染色陽性例次率（抗酸染色陽性例次率為15.04%），肺結核痰涂片陽性檢出率與國內痰涂片21.0%報道值相近，但本研究的PCR法檢測陽性率低于國內64.0%～90%的報道的報道[1-3]。

我院結核性胸膜炎胸水熒光定量PCR法的陽性檢出例次率為12.03%。明顯低于應用PCR技術檢測胸水中的TB-DNA，敏感性為38.5%的報道，主要是出現假陰性所致，出現假陰性的原因是DNA聚合酶活力不夠，或因有酚、氯仿等物存在而使其活性受到抑制等因素影響PCR循環擴增效率，減少特異性DNA擴增產量。有學者報道約5%的標本組中測到抑制物的存在，據認為是DNA聚合酶的抵制物[4]。

肺結核是由結核分枝桿菌感染而引起的慢性呼吸系統傳染病，根據WHO統計，目前全世界共有2000萬肺結核病人，其中95%在發展中國家，而我國排列世界第二，僅活動性肺結核病人就有近500萬。實時熒光定量聚合酶鏈反應技術因其快速簡便，靈敏度高，特異性高等優點，已經成為結核病實驗室診斷的重要輔助手段[5]。本研究肺結核患者痰菌陽性病人TB-DNA陽性例次率為23.53%。非肺結核患者出現6例痰熒光定量PCR法TB-DNA出現假陽性，假陽性例次率為9.60%，分析其原因考慮為在標本預處理和DNA純化過程操作不當造成的標本污染所致的假陽性[6]。我院肺結核患者TB-DNA假陰性率為70.21%，靈敏度為29.8%，特異度為90.3%，故假陰性高，假陽性亦高，靈敏度低，特異度亦不高，且痰涂片抗酸桿菌陽性病人的痰TB-DNA陽性例次率僅為23.53%，故痰或胸水TB-DNA檢驗結果陽性不能肯定肺結核，陰性亦不能排除肺結核，雖痰TB-DNA陽性率高于痰涂片陽性率，但臨床診斷價值不大，故痰或胸水熒光定量PCR法查TB-DNA不作為疑似肺結核病人的常規檢查。

[參與文獻]

[1]吳國蘭，陳曉紅，李學玲，等，4種不同支氣管肺泡灌洗液結核桿菌檢測方法在肺結核診斷中的應用研究[J].中國臨床醫生，2013，41（3）39-41.

[2]牛海軍，張信鴿，趙長生，等.實時定量PCR技術在肺結核診斷中的價值[J].ATD醫藥論壇雜志，2013，34（9）：132-133.

[3]孫集思，陳亦洋.PCR法檢測痰液結核桿菌對診斷價值的研究[J].中國社區醫師，2012，14（2）：266.

[4]徐偉，張小潤，高林虎.PCR診斷結核性炎的臨床評價[J].中國煤炭工業醫學雜志，2010，13（7）：1045-1046.

[5]牛海軍，張信鴿，趙長生，等.實時定量PCR技術在肺結核診斷中的價值[J].醫藥論壇雜志，2013，34（9）：132-133.

[6]李銳成，劉昕陽，鄒菊賢，等，3860例不同標本結核分枝桿菌DNA檢測結果分析[J].中國衛生檢驗雜志，2013，23（8）：1987-1989.

R521

A

1672-5654（2014）10（a）-0156-02

2014-08-05）

韋毅（1973-），男，漢族，貴州省興義市人，碩士，副主任醫師，主要從事傳染病診療工作。