胃癌組織中ERCC1基因實時熒光定量PCR表達及臨床意義

李紫燕張翼張士虎

1.常州市腫瘤醫院病理科，江蘇常州213000；2.江蘇省中醫院急診外科，江蘇南京210029

胃癌組織中ERCC1基因實時熒光定量PCR表達及臨床意義

李紫燕1張翼2張士虎2

1.常州市腫瘤醫院病理科，江蘇常州213000；2.江蘇省中醫院急診外科，江蘇南京210029

目的探討ERCC1基因在胃癌中的表達及臨床意義。方法應用實時熒光定量PCR檢測44例胃癌組織中ERCC1基因的表達，并分析ERCC1基因表達與患者生存的關系。結果ERCC1在胃癌組織中的表達與年齡、組織學分級、淋巴結轉移、臨床分期等因素無關，而與性別有關。ERCC1高表達病例3年生存率33.3%(8/24)，ERCC1低表達病例3年生存率60.0%(12/20)，ERCC1低表達患者3年生存率更高,但是兩者差異無統計學意義(P=0.077)。結論ERCC1與胃癌分化程度、有無淋巴結轉移等無關，提示ERCC1與腫瘤的不良生物學行為無關。ERCC1基因在胃癌中不能作為獨立的預后指標。

胃癌；Q-PCR；ERCC1；預后

胃癌是全世界第二大致死性癌癥，尤其是進展期胃癌（AGC）和胃-食管交界部癌(GEJ)患者的臨床生存率普遍較差，傳統化療方案的中位生存期為9～11個月。順鉑和5-氟尿嘧啶(5-FU)是胃癌治療的經典化療藥物，但是胃癌是異質性很強的腫瘤，病理類型的差異、遺傳因素和發生部位的差別都可以導致胃癌療效差異顯著。有研究發現,DNA修復家族成員核苷酸切除修復基因1（ERCC1)是較好的化療療效預測指標,低表達患者鉑類藥物敏感,療效較好[1]。ERCC1基因表達在胃癌中的作用尚沒有定論，胃癌患者ERCC1表達水平與預后的關系仍存在著爭議。本研究利用胃癌石蠟標本,用RT-QPCR方法進行檢測并對該基因的臨床意義進行分析。

1 資料與方法

1．1臨床與病理資料

標本44例胃癌石蠟標本及對應的血液標本(2008年1月—2010年8月)由江蘇省中醫院病理科提供。其中男性31例,女性13例，年齡36～80歲,中位年齡60歲。組織學分級高分化2例，中分化8例，低分化34例；腫瘤部位胃-食管交界部癌3例，胃癌41例；有淋巴結轉移者38例，無淋巴結轉移者6例。所有病例術前均無鉑類化療史。所有病例均由病理診斷證實。

1．2基因組RNA抽提及RT－QPCR

按照試劑盒說明提取石蠟RNA(RNase－free FFRE Kit,Qiagen)和血RNA(Blood RNA Kit,Omega)。取1μL RNA加99 μL RNase Free ddH2O,在紫外分光光度儀上測定其濃度和純度。進一步行RT反應(10μL):gDNA:1μL,6μlRNA＋DEPC H2O,42℃2 min,然后加入0.5μL Primer(10nmol/μL),0.5μL RT酶,2μL Buffer,42℃30 min,

95℃5 min。QPCR反應體系(5μL):Master Mix:2.5μL,模板cDNA 1μL,ERCC1上下游引物各0.25μL(20pmol/μL)，H2O:1μL。PCR擴增條件:95℃10min預變性,95℃15 s,60℃1min擴增50個循環。溶解曲線的溫度設定:95℃15 s,60℃15 s,95℃15 s。

1．3 SYBR Green熒光實時定量PCR數據分析

以ACTB基因為內參,利用待測樣本的Ct值(3復管均值)求出相應基因拷貝數作為檢測結果。Ct值閾值納入范圍設置為15～35個循環。

1．4隨訪

對44例胃癌患者及其家屬于2013年8月進行電話隨訪。所有患者的隨訪內容包括性別、年齡、確診日期、手術日期、死亡日期、死亡原因(截止于2013年8月31日)。

1．5統計學分析

2 結果

2.1 ERCC1基因在胃癌中表達的情況

44例胃癌組織中ERCC1與內參的差值Δct與cut off值4.3[2]相比較,低表達和高表達者分別為27例和17例。

2.2 ERCC1基因表達與胃癌病理學特征的關系

研究結果顯示：胃和胃食管交界部位癌相比較，ERCC1的表達高低沒有統計學差異（P＞0.05）；不同的組織學分級和臨床分期在ERCC1高表達組與低表達組中也沒有顯示出統計學差異（P＞0.05）。ERCC1基因的表達與發病性別有關,與年齡、腫瘤部位、組織學分級、淋巴結轉移情況、臨床分期無關。ERCC1基因低表達在女性患者中(12/13,92.3%)所占比例與男性患者(15/31，48.4%)相比較有顯著統計學差異，見表1。

表1 ERCC1基因表達與胃癌患者臨床病理特征的關系

2.3 ERCC1基因表達與胃癌患者生存的關系

隨訪病例三年生存率為45.5%。本實驗將44例獲得隨訪的胃癌患者分成兩組：生存組20例，其中低表達者12例，高表達者8例；死亡組24例，其中低表達者8例，高表達者16例，并對兩組中ERCC1基因表達情況作了分析。胃癌中ERCC1低表達在死亡組中為33.3%(8/24)，低于生存組60.0%(12/20)，兩組比較差異沒有顯著統計學意義(χ2=3.129，P=0.077)。

3 討論

ERCC1是細胞內DNA損傷修復通路中的關鍵基因，具有核苷酸切除修復系統（NER）的重要功能。多項研究顯示ERCC1低表達患者可從輔助化療獲益，ERCC1高表達患者則不能從輔助化療中獲益[3-4]。目前ERCC1基因表達在胃癌中的作用尚不明確，國內研究[5-7]多采用免疫組化的方法檢測ERCC1蛋白的表達，本研究應用實時熒光定量PCR的方法，更能準確地從基因水平上檢測胃癌中ERCC1的表達情況。徐大洲[5]，宋延強[6]等研究表明ERCC1在胃癌表達與性別、年齡、組織學類型、淋巴結轉移及TNM分期無關，但都是采用免疫組化的方法從蛋白水平上檢測表達。免疫組化有其自身的局限性，例如判讀結果往往帶有主觀性并依賴于制片質量的好壞。本研究采用實時熒光定量PCR方法對44例胃癌組織進行ERCC1基因表達水平的檢測，結果顯示ERCC1在腫瘤組織中表達與年齡、腫瘤部位、組織學分級、淋巴結轉移及臨床分期無關，但是與性別有關。在國外一項2540例非小細胞肺癌參與的大型研究結果顯示[8],ERCC1表達水平在男女中有顯著差異,女性更易低表達,和本研究結果相似，提示了女性更易從輔助化療中獲益。Jina[9]等用免疫組化方法檢測了89例進展期胃癌的ERCC1表達，結果顯示ERCC1蛋白表達并不能用于指導化療的反應性及預后的判斷。而徐大洲等對85例I～III期胃癌患者進行了回顧性研究，結果顯示ERCC1蛋白可預測胃癌術后鉑類輔助化療的敏感性，ERCC1蛋白表達水平是胃癌術后患者獨立的生存預后因素，與國外研究結論不一致。本研究結果顯示盡管ERCC1低表達患者3年生存率更高,但是兩者差異無統計學意義，尚不能作為獨立的生存預后因素，與國內報道[5]不一致的原因可能是由于檢測方法及檢測水平不同所致，還可能是由于腫瘤的分期不同所致。

關于胃癌組織中ERCC1基因表達對鉑類藥物敏感性的預測作用和對胃癌治療后生存期的影響的研究還在進行中。國內外研究[6-11]顯示ERCC1表達可能與進展期胃癌患者的化療敏感性及預后有關，ERCC1低表達患者生存期較高表達患者生存期延長。王瓊[12]等對120例進展期胃癌進行了ERCC1基因mRNA表達水平的檢測，并根據檢測結果針對性的選擇化療方案，使得有效率從常規化療的40%提高到58%。但是ERCC1基因在胃癌中是否能作為獨立的預后指標尚具爭議。最新ASCO會議報道ERCC1不能作為肺癌的獨立預后指標[13]，其在腫瘤中的作用還需要進一步研究。本研究結果顯示ERCC1高表達病例3年生存率33.3%，ERCC1低表達病例3年生存率60.0%，低表達者生存率比高表達

者高，但是兩者差異無統計學意義（P=0.077），提示ERCC1基因在胃癌中尚不能作為獨立的預后指標。對于ERCC1基因的表達在胃癌預后中的意義需要進行更大樣本的多中心研究。

總之,目前結果顯示ERCC1低表達者生存較好，可能與鉑類化療敏感相關。因此,檢測術后患者ERCC1基因的表達有助于指導胃癌的個體化治療，值得在臨床中進一步推廣研究。

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Expression and clinical significance of ERCC1 in gastric cancer

LI Ziyan1ZHANG Yi2ZHANG Shihu2
1.Department of Pathology，Changzhou Cancer Hospital,Changzhou,Jiangsu Province，Jiangsu 213000,China 2.Department of Emergency medicine，the Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM,Nanjing,Jiangsu Province，Jiangsu 210029,China

ObjectiveTo evaluate the significance of ERCC1 in gastric cancer and the relationship between these markers and clinicopathologic parameter as well as clinical outcome.MethodsReal-time PCR was used in detecting the expression of ERCC1 in 44 cases of microdissected formalin-fixed paraffin-embedded gastric cancer.ResultsThe expression of ERCC1 in gastric cancer was correlated with gender(P=0.006)rather than age,histological grade,lymph node metastasis and TNM stage(P＞0.05). The patients with low expression of ERCC1 showed higher survival rate,but it did not reach statistically significant difference(P＞0.05);ConclusionThe expression of ERCC1 in gastric cancer was not correlated with histological grade and lymph node metastasis,which indicate that the expression of ERCC1 has no relationship with tumor biological behavior.ERCC1 gene can not be considered as an independent prognosis factor.

Gastric;Q-PCR;ERCC1;Prognosis

R4

A

1672-5654（2014）10（a）-0026-03

2014-07-15）

張翼(1979-),男,江蘇省如皋市人,碩士研究生,主治醫師,研究方向:普外科。

李紫燕(1987-),女,江蘇省常州市人,本科,初級病理技師,研究方向:分子病理。