高脂飲食對模擬低氧環境SD大鼠主動脈的影響

趙艷霞 張廣梅 趙協慧

青海大學醫學院中醫系，青海西寧810000

高脂飲食對模擬低氧環境SD大鼠主動脈的影響

趙艷霞 張廣梅 趙協慧

青海大學醫學院中醫系，青海西寧810000

目的研究高脂飲食對模擬低氧環境SD大鼠主動脈的影響及其可能機制。方法20只雄性SD大鼠隨機分為低氧組和低氧聯合高脂飲食組，普通飲食或高脂飲食，4周后留取外周血及主動脈標本，采用TBA比色法檢測血漿丙二醛(MDA)含量、WST-1法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活力、硝酸還原酶法檢測硝酸鹽/亞硝酸鹽(NOx)水平、終點法和直接檢測法檢測血脂含量，HE染色觀察主動脈病理形態改變，Western blot法檢測主動脈內皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表達水平。結果病理切片顯示低氧組大鼠主動脈內皮細胞腫脹，局部內膜脫落，平滑肌細胞增生，低氧聯合高脂飲食組主動脈局部內膜大片脫落，平滑肌細胞明顯增生，核變圓，胞漿空泡變明顯，細胞排列紊亂。低氧聯合高脂飲食組與低氧組主動脈蛋白表達水平無明顯變化。與低氧組（75.95±12.48）μmol/L,（0.26±0.0）4mmol/L,（1.55±0.10）mmol/L,（178.79±16.85）U/mL,（6.49±0.87）nmol/ mL比較，血漿NOX含量（23.19±7.10）μmol/L明顯降低，低密度脂蛋白（0.91±0.04）mmol/L與總膽固醇（2.36±0.22）mmol/L水平明顯升高；低氧聯合高脂飲食組大鼠血漿SOD活力（163.89±8.16）U/mL與MDA含量（4.31±1.10）nmol/mL顯著低于低氧組(P＜0.05)。結論低氧環境下，高脂飲食加重了SD大鼠主動脈損傷，其機制可能與抗氧化能力不足及血脂異常引起血漿NOX水平降低有關。

內皮型一氧化氮合酶；一氧化氮；低氧；高脂

內皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化左旋精氨酸產生的一氧化氮(NO)有擴張血管、抑制平滑肌細胞增殖和抑制血小板聚集等作用，可調節血管張力、維持血管穩態，對心血管系統具有多重保護作用，是臨床評定內皮功能的重要指標[1]。高脂血癥可降低常氧環境機體NO的生成與生物利用度，減弱其對血管的保護作用，引起內皮損傷，平滑肌細胞增殖，啟動心血管疾病的發生與發展[2]。高脂血癥對低氧環境人群主動脈存在怎樣的影響尚不明確。本研究通過觀察SD大鼠主動脈病理形態變化、檢測主動脈eNOS蛋白表達及血漿硝酸鹽/亞硝酸鹽(NOx)含量(間接反映NO含量)，探討高脂飲食對模擬低氧環境機體主動脈的影響及其機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物2012年9月22日—10月26日，將20只體重180～200 g的6周齡清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠(雄性，中國藥科大學提供)隨機分為兩組：低氧(H)組與低氧聯合高脂飲食(H+ HFD)組，每組10只，于低壓氧艙模擬海拔5000 m。H+HFD組大鼠灌服脂肪乳劑，10 mL/kg/d，1次/d；H組大鼠灌服等體積生理鹽水，普通飲食。于4周末抽取大鼠靜脈血，置于抗凝管，并留取主動脈標本于-80℃冰箱保存。

1.1.2 脂肪乳劑采用前期研究的方法制備脂肪乳劑[3]。

1.1.3 主要儀器和試劑冷凍離心機、DU800核酸蛋白儀(德國BECKMAN)，低壓氧艙室(貴州風雷航空機械有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及一氧化氮(NO)試劑盒由南京建成生物公司提供，血脂檢測試劑盒、BCA蛋白分析試劑盒、eNOS及βactin一抗、二抗分別由北京利德曼生化股份有限公司、Pierce Chemical Company、Abcam公司、Santa Cruz Biotechnology lnc提供。

1.2 方法

1.2.1 主動脈病理形態觀察取主動脈標本固定，脫水，包埋，切片，HE染色，觀察病理形態改變。

1.2.2 血漿SOD活力和MDA含量測定于3000 r/min離心抗凝血（10 min），分離血漿。用WST-1法、TBA比色法分別檢測血漿SOD活力及MDA含量。

1.2.3 血脂水平檢測采用直接測定法檢測血漿高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量，采用終點法檢測血漿總膽固醇(TCH)及甘油三酯(TG)含量。

1.2.4 血漿NOX水平檢測采用硝酸還原酶法檢測血漿NOX水平。

1.2.5 主動脈eNOS蛋白水平檢測將主動脈切成小塊，裂解組織，勻漿，離心，取上清，檢測樣品總蛋白濃度。用5×蛋白上樣緩沖液于100℃變性5 min。采用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白。使用半干轉印槽將蛋白轉印至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h，然后加兔抗eNOS(1:250)，β-actin(1:1000)，4℃孵育過夜。于洗膜后用辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗(1:6000)室溫孵育2 h，使用ECL液發光顯影。膠片掃描后用ImageJ軟件分析，計算目的與內參條帶積分光密度值的相對比值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 主動脈病理形態變化

H組內皮細胞腫脹，核變圓，局部內膜脫落，平滑肌細胞增生，細胞核變橢圓，局部胞漿疏松，細胞輕度排列紊亂；H+HFD組局部內膜大片脫落，內皮細胞腫脹，平滑肌細胞明顯增生，細胞核變圓，胞漿空泡變明顯，細胞排列紊亂，見圖1。

圖1 主動脈病理形態變化

2.2 血脂水平檢測

H+HFD組LDL、TCH含量明顯高于H組，兩組間的TG與HDL水平無明顯差異，見表1。

表1 兩組大鼠血脂水平變化(mmol/L±s)

表1 兩組大鼠血脂水平變化(mmol/L±s)

注：P＜0.05 vs H。

組別TCH TG LDL HDL H H+HFD tP 1.55±0.10 2.36±0.22△-9.666＜0.001 0.54±0.06 0.53±0.08 0.136 0.893 0.26±0.04 0.91±0.04△-32.869＜0.001 0.37±0.05 0.36±0.04 0.604 0.555

2.3 血漿MDA含量與SOD活力的測定

H+HFD組MDA含量與SOD活力均明顯低于H組，見表2。

2.4 血漿NOx水平測定

H+HFD組大鼠血漿NOx含量低于H組，見表2。

2.5 主動脈eNOS蛋白表達水平測定

H組(0.82±0.15)與H+HFD組(0.91±0.17)大鼠主動脈eNOS蛋白表達水平無明顯差異(t=-0.885,P=0.402)。

表2 兩組大鼠血漿MDA、SOD及NOx水平變化(±s)

表2 兩組大鼠血漿MDA、SOD及NOx水平變化(±s)

注：P＜0.05 vs H。

組別MDA(nmol/mL) SOD(U/mL) NOx(μmol/L) H H+HFD tP 6.49±0.87 4.31±1.10△4.384 0.001 178.79±16.85 163.89±8.16△2.251 0.041 75.95±12.48 23.19±7.10△10.394＜0.001

3 討論

本研究通過觀察SD大鼠主動脈病理形態變化、檢測主動脈eNOS蛋白表達及血漿NOx含量，探討高脂飲食對模擬低氧環境機體主動脈的影響及其機制。結果顯示，相對于低氧組，低氧聯合高脂飲食組主動脈病理損傷加重，eNOS蛋白表達水平無明顯變化，而血漿NOx含量明顯降低，血漿TCH及LDL明顯升高；低氧聯合高脂飲食組血漿SOD活力低于低氧組，表明高脂飲食可加重模擬低氧環境大鼠主動脈的損傷。

NO是高原適應與習服的重要指標之一，高原世居藏族循環血NO代謝產物高于低海拔人群的水平，可增加血流灌注及氧傳遞，以抵消低氧影響，而機體NO含量降低則可引起高原適應不良[4-5]。本研究中低氧聯合高脂飲食組血漿NOx含量明顯低于低氧組，與文獻報道一致[6]，即高脂飲食可使模擬低氧環境SD大鼠血漿NO含量降低，減弱了其對血管的保護作用，加重了血管內皮的損傷，導致內膜大片脫落，平滑肌細胞明顯增生，細胞核變圓，胞漿空泡變，細胞排列紊亂。另外，血漿NO含量降低還可影響血管內皮細胞功能，使其釋放擴血管物質減少，縮血管物質增多，進而加重了血管收縮與重構[7]。提示對于慢性重度低氧性疾病的患者，高脂血癥可能是其動脈損傷加重的獨立危險因素。

本研究中，低氧聯合高脂飲食組大鼠血漿LDL與TCH濃度明顯高于低氧組，血脂異常可誘導小窩蛋白，降低eNOS從質膜上解離，降低eNOS的酶活性，即eNOS蛋白表達不降低而NO產生減少原因之一。同時，血脂異常還可引起機體抗氧化能力降低，即抗氧化指標SOD活力降低。減弱其清除機體代謝過程中產生過氧化物的能力，引起eNOS出現無用的代償性改變，致使eNOS脫偶聯[8]，減少NO生成，增加NO清除，降低其生物利用度。既往研究亦證實抗氧化能力不足致血管內皮損傷及內皮源性NO生成減少，補充抗氧化劑可糾正血管內皮損傷[9]。

綜上所述，本研究結果表明與單純低氧相比，聯合高脂飲食降低大鼠抗氧化能力，降低血漿NOx水平，加重了主動脈損傷。提示長期高脂飲食可能是慢性重度低氧環境機體主動脈損傷的獨立危險因素，其主要原因可能是抗氧化能力降低，應積極干預和治療。但也有研究認為聯合高脂飲食并未加重低氧環境大鼠血管損傷，分析原因可能與低氧的方式、程度及時間不同有關，需進一步研究證實[10]。因大鼠與人體間存在差異，高脂飲食對慢性重度低氧環境人主動脈的影響不能由本研究結果完全反映，有待進

一步的研究。

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[3]趙艷霞,張廣梅,趙協慧,等.高脂飲食對模擬低氧環境SD大鼠肺組織eNOS/NO的影響[J].青海醫學院學報，2014,35(1):8-12.

[4]王秀娟,楊舒黎,李帥,等.一氧化氮在動物低氧適應中的生理和分子機制[J].中國畜牧獸醫，2011,38(5):62-65.

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[6]Barreto-Filho JA,Consolim-Colombo FM,Guerra-Riccio GM,et al.Hypercholesterolemia blunts forearm vasorelaxation and enhances the pressor response during acute systemic hypoxia[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003,23(9):1660-1666.

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R4

A

1672-5654（2014）09（c）-0157-03

2014-07-10）

趙艷霞（1980-），女，漢族，黑龍江省安達市，碩士研究生，講師，主要從事心血管病研究。