4種分離培養(yǎng)基檢測志賀氏菌效果比較

王建昌，陳志敏，李靜，王金鳳，姜彥芬，孫曉霞

（河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，河北石家莊050051）

4種分離培養(yǎng)基檢測志賀氏菌效果比較

王建昌，陳志敏，李靜，王金鳳，姜彥芬，孫曉霞

（河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，河北石家莊050051）

志賀氏菌是一類具有高度傳染性的腸道致病菌。文中基于GB 4789.5—2012《志賀氏菌檢驗》標準，比較了4種分離培養(yǎng)基檢測志賀氏菌的效果。通過4種分離培養(yǎng)基對福氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌的回收率、最低檢出限及對不同樣品檢測效果的比較，對不同培養(yǎng)基的檢測效果進行評價。結果顯示4種分離培養(yǎng)基最低檢出限相近，顯色培養(yǎng)基01檢測特異性優(yōu)于其他3種；針對實際檢測樣品，應靈活選擇培養(yǎng)條件，以提高檢測的準確性及效率。

福氏志賀氏菌；宋內氏志賀氏菌；顯色培養(yǎng)基；檢測效果比較

志賀氏菌屬是一類革蘭氏陰性桿菌，是人類細菌性痢疾最為常見的病原菌[1]，通稱痢疾桿菌，為兼性厭氧菌[2]，按照抗原結構和生化反應的不同分為痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）、鮑氏志賀氏菌（Shigella boydii）和宋內氏志賀氏菌（Shigella sonnei）。在發(fā)達國家志賀氏菌感染主要為宋內氏志賀氏菌，而在我國流行菌株則以福氏志賀氏菌為主[3-6]。志賀氏菌引起痢疾的傳染源主要為病人和帶菌者，主要是通過污染了志賀氏菌的食物、飲水等經口感染，具有十分重要的公共衛(wèi)生學意義[7]。人類對志賀氏菌感染度極高。在食物衛(wèi)生檢驗時，志賀氏菌常作為必檢指標之一，因此及時準確的檢測手段是預防和控制志賀氏菌傳播的關鍵。

目前食品中志賀氏菌的檢測方法主要有常規(guī)生化鑒定方法、免疫學方法、分子生物學方法[8-17]，但無論使用何種方法，從檢測樣品中準確分離到目標菌是確證的關鍵。鑒于志賀氏菌在進出口食品檢測、國內食品日常監(jiān)測中的重要性，國家衛(wèi)計委志賀氏菌最新版檢測標準由推薦性改為強制性國標GB 4789.5—2012《食品安全國家標準食品微生物學檢驗志賀氏菌檢驗》，且在分離培養(yǎng)時增加了顯色培養(yǎng)基。顯色培養(yǎng)基是一種新型的微生物檢測手段，培養(yǎng)基中加入檢測目標菌的特征性酶的顯色底物，當目標菌在培養(yǎng)基上生長時，其特征性酶就能降解顯色底物并產生帶有特殊顏色的代謝物，使菌落形成特定的顏色或形態(tài)，而干擾菌被抑制或不產生特征性酶而不顯色，因而能被有效區(qū)別開來。使用顯色培養(yǎng)基對致病菌進行檢測能節(jié)省大量人力、財力和時間，也大大減少假陰性的機會，而且還能對目標菌行定量檢測[18]。

本研究選擇我國主要流行的志賀氏菌-福氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌，通過實驗室常用的3種顯色培養(yǎng)基及木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽（xylose lysine desoxycholate，XLD）培養(yǎng)基對福氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌的回收率、最低檢出限，以及對人工污染樣品的檢測效果進行比較，旨在選擇最適合實驗室使用的志賀氏菌檢測培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

福氏志賀氏菌CICC21678、宋內氏志賀氏菌CICC21679：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；志賀氏菌增菌肉湯、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：北京路橋技術有限責任公司；顯色培養(yǎng)基01，由法國公司開發(fā)，由顯色培養(yǎng)基基礎及添加劑配制，志賀氏菌呈白色/清晰菌落，檢測時間為20～24h；顯色培養(yǎng)基02，由國內生物技術公司開發(fā)，由顯色培養(yǎng)基基礎及顯色劑、瓊脂配制，志賀氏菌呈白色或無色菌落，檢測時間為20～24h；顯色培養(yǎng)基03購自國內生物技術公司，由顯色培養(yǎng)基基礎及添加劑配制，志賀氏菌呈白色/清晰菌落，周圍培養(yǎng)基呈紅色，檢測時間為20～24h；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽（XLD）瓊脂培養(yǎng)基購自國內生物技術公司，志賀氏菌呈粉紅色至無色菌落，檢測時間為20h～24h。

羊肉（菌落總數：1.1×105CFU/g；大腸菌群：46 000MPN/100g）、奶粉（菌落總數：1.8×102CFU/g；大腸菌群<30MPN/100g）、果汁（菌落總數<10CFU/g；大腸菌群<30MPN/100g）：市售。

1.2 儀器與設備

DensiCHEK比濁儀：法國梅里埃公司；mini MACS厭氧工作站：英國Don Whitley Scientific公司；SEWARD3500拍擊式均質器：英國SEWARD公司；MIR-254-PC低溫恒溫培養(yǎng)箱：日本Panasonic公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準菌株回收率實驗

分別將福氏志賀氏菌CICC21678、宋內氏志賀氏菌CICC21679新鮮培養(yǎng)物用生理鹽水稀釋至濃度約為1× 108CFU/mL，進行10倍梯度稀釋，取10-6、10-7兩個梯度菌液各0.5mL，分別涂布營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（對照）、顯色培養(yǎng)基01、顯色培養(yǎng)基02、顯色培養(yǎng)基03、XLD培養(yǎng)基（試驗均做2個平行），37℃，24h培養(yǎng)后觀察結果，統計各培養(yǎng)基上生長的菌落總數，計算回收率，分離培養(yǎng)基回收率計算公式：

1.3.2 4種分離培養(yǎng)基最低檢出限對比

分別將福氏志賀氏菌CICC21678、宋內氏志賀氏菌CICC21679新鮮培養(yǎng)物稀釋到不同濃度，添加到志賀增菌肉湯培養(yǎng)后對4種分離培養(yǎng)基進行最低檢出限對比。

1.3.3 人工污染樣品的檢測

菌液制備：將福氏志賀氏菌CICC21678、宋內氏志賀氏菌CICC21679新鮮培養(yǎng)物制成菌懸液，福氏志賀氏菌分別為102CFU/mL、10CFU/mL；宋內氏志賀氏菌分別為50CFU/mL、5CFU/mL。

樣品處理及檢測：分別取25g（或25mL）于225mL志賀氏菌增菌肉湯均質袋中，用拍擊式均質器連續(xù)均質1～2min，液體樣品振蕩混勻即可。于41.5℃厭氧培養(yǎng)8～20h，相同條件下準備2組平行樣。

分離：取增菌液分別劃線接種顯色培養(yǎng)基01、顯色培養(yǎng)基02、顯色培養(yǎng)基03、XLD培養(yǎng)基，比較幾種選擇性分離培養(yǎng)基對志賀氏菌的檢出效果。

2 結果與分析

2.1 對志賀氏菌的檢出回收率對比

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長菌落總數理論上為每個分離培養(yǎng)基最多檢出的陽性志賀氏菌菌落數。

由表1、表2可看出，顯色培養(yǎng)基01對兩株志賀氏菌均為回收率最高，說明顯色培養(yǎng)基01對志賀氏菌的分離效果好。

表1 福氏志賀氏菌純菌回收率試驗結果Table 1 Recovery rate ofShigella flexneristrains on different medium

表2 宋內氏志賀氏菌純菌回收率試驗結果Table 2 Recovery rate ofShigella sonneistrains on different medium

2.2 4種分離培養(yǎng)基對志賀氏菌最低檢出限對比

由表3、表4可知，4種分離培養(yǎng)基對福氏志賀氏菌最低檢出限均可達到8CFU/mL，對宋內氏志賀氏菌最低檢出限均可達到5CFU/mL。

表3 分離培養(yǎng)基對福氏志賀氏菌的最低檢出限Table 3 Minimum detection limits ofShigella flexnerion different medium

表4 分離培養(yǎng)基對宋內氏志賀氏菌的最低檢出限Table 4 Minimum detection limits ofShigella sooneion different medium

2.3 人工污染樣品檢測對比

由表5為福氏志賀氏菌添加，表6為宋內氏志賀氏菌添加。由表5、表6可知，在檢測樣品中，顯色培養(yǎng)基01對福氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌檢測效果最好，且高污染樣品（羊肉）不同添加濃度在培養(yǎng)8h時，4種培養(yǎng)基均可檢出，而在培養(yǎng)20h后只有顯色培養(yǎng)基01可檢出，其余均無典型菌落生長。中污染（奶粉）、低污染樣品（果汁）在不同菌液濃度、不同培養(yǎng)時間無明顯差異。

表5 分離培養(yǎng)基檢測福氏志賀氏菌人工污染樣品結果比較Table 5 Comparison of isolation medium detecting artificially contaminated food withShigella flexneri

表6 分離培養(yǎng)基檢測宋內氏志賀氏菌人工污染樣品結果比較Table 6 Comparison of isolation medium detecting artificially contaminated food withShigella soonei

在檢測樣品中，顯色培養(yǎng)基01對福氏志賀氏菌、宋內氏志賀氏菌檢測效果最好，顯色培養(yǎng)基03、XLD次之，顯色培養(yǎng)基02最差。

高污染樣品（羊肉）在添加福氏志賀氏菌時不同濃度時，8h增菌培養(yǎng)后4種培養(yǎng)基均可檢出，而在培養(yǎng)20h后只有顯色培養(yǎng)基01檢出，而其他均被雜菌覆蓋，無法檢出；在添加宋內氏志賀氏菌高于最低檢出限10倍濃度時，8h培養(yǎng)后均可檢出，20h后僅顯色培養(yǎng)基01和顯色培養(yǎng)基03可檢出，在添加最低檢出限濃度時僅顯色培養(yǎng)基01表現出較大優(yōu)勢。中污染（奶粉）樣品在8h檢測時2種志賀氏菌有個別無檢出，而20h培養(yǎng)后均可檢出。低污染（果汁）樣品在不同濃度不同培養(yǎng)時間均可檢出2種志賀氏菌，4種培養(yǎng)基之間無差異。本實驗結果表明在背景污染較重的樣品檢測時應在8h、20h分別接種劃線分離（可幾種培養(yǎng)基同時聯合使用）以防止漏檢，而中污染、低污染樣品在20h培養(yǎng)后劃線分離即可。

3 結論

通過以上實驗結果可以看出，4種分離培養(yǎng)基對目標菌和非目標菌的生長和選擇均能達到基本性能要求，且不同濃度志賀氏菌在不同培養(yǎng)基上回收率不同以及不同食品種類、污染程度、增菌培養(yǎng)時間都對檢出效果有一定影響。志賀氏菌顯色培養(yǎng)基01在本研究中表現出較大的優(yōu)勢，為檢測效率和準確度提供了保障。但是顯色培養(yǎng)基01在使用過程中也存在一些假陽性的問題，例如惡臭假單胞菌單從菌落形態(tài)上很難和志賀氏菌在顯色培養(yǎng)基01上進行區(qū)分，需要進行進一步的初步生化確證實驗。

使用方便、靈敏高效的顯色培養(yǎng)基成品及試劑盒將是微生物快速檢測新技術最有潛力的方向之一，但是顯色培養(yǎng)基在檢測食品樣品會遇到更多的挑戰(zhàn)，不僅干擾菌的種類更多更復雜，而且食品的成分和添加劑更可能影響顯色培養(yǎng)基的檢測特性。使用顯色培養(yǎng)基進行致病菌檢測時，應該充分考慮樣品污染背景，選擇合適的增菌時間，從而避免漏檢和假陰性檢測結果的出現。

[1]王叔淳.食品衛(wèi)生檢驗技術手冊[M].北京：化學工業(yè)出版社，2002.

[2]SHAKOOR S,ZAIDI A,HASAN R.Tropical bacterial gastrointestinal infections[J].Infect Dis Clin N Am,2012,26(2):437-453.

[3]王曉萌，有田世乃，增田志高，等.腸道致病菌暴發(fā)事件中分子分型技術的應用[J].中華預防醫(yī)學雜志，2006，40（2）：39-42.

[4]蔣鴻超，黃海林，蘇敏，等.小兒細菌性痢疾147例志賀菌菌型及耐藥性分析[J].兒科藥學雜志，2013，19（2）：43-46.

[5]邱亞群，林一曼，張倩，等.深圳市食品、公共場所從業(yè)人員志賀氏菌屬帶菌情況分析[J].實用預防醫(yī)學，2004，11（2）：175-176.

[6]康燕明.怒江州2006-2010年志賀氏菌菌型分布及耐藥性變遷分析[J].中國衛(wèi)生產業(yè)，2012，34：136.

[7]嚴睿，朱鳳才.志賀菌分子生物學檢測技術研究進展[J].中國病原生物學雜志，2008，3（6）：464-467.

[8]中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與食品安全所.GB/T4789.5—2012.食品微生物學檢驗志賀氏菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2012.

[9]鐘青萍，葛萃萃，張世偉，等.檢測食品中志賀氏菌的雙抗夾心ELISA方法的研究[J].食品科技分析檢測，2007，32（10）：199-202.

[10]秦巧玲.志賀氏菌多克隆抗體制備及ELISA檢測方法的建立[D].武漢：華中農業(yè)大學碩士論文，2008.

[11]李君文，晁福寰，靳連群，等.基因芯片技術快速檢測水中常見致病菌[J].中華預防醫(yī)學雜志，2002，36（4）：238.

[12]BARLETTA F,LIU Q A,CLEARY T,et al.Detection ofCampylobacterspp,Salmonellaspp,andShigellaspp.enteropathogens by real-time multiplex PCR[J].Trop Medi Int Health，2011,16:255-256.

[13]吳平芳，石曉路，鄭琳琳，等.改良分子信標-實時PCR快速檢測志賀氏菌[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2006，16（4）：394-395，468.

[14]劉成志，錢凱，李潔莉，等.乳飲料中志賀氏菌的快速PCR檢測技術研究[J].江蘇食品與發(fā)酵，2009（1）：1-5.

[15]徐鋒，武曉麗，徐迪，等.牛奶樣品中志賀氏菌膠體金免疫試紙條檢測方法的建立[J].中國乳品工業(yè)，2012，40（5）：40-50.

[16]趙麗華，周勇，萬成松.分子信標PCR檢測志賀菌ipaH基因[J].熱帶醫(yī)學雜志，2006，6（5）：499-502.

[17]甘莉萍，劉渠，陳應堅，等.熒光定量PCR和DNA分子分型在菌痢暴發(fā)中的應用[J].現代預防醫(yī)學，2007，34（5）：937-938，941.

[18]SILVA B O,CARAVIELLO D Z,RODRIGUES A C,et al.Evaluation of Petrifilm for the isolation ofStaphylococcus aureusfrom milk samples[J].J Dairy Sci,2005,88(8):3000-3008.

Comparison of theShigella detection effect with four common culture media

WANG Jianchang,CHEN Zhimin,LI Jing,WANG Jinfeng,JIANG Yanfen,SUN Xiaoxia
(Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Technical Center,Shijiazhuang 050051,China)

Shigellais a common pathogenic species with highly contagious.Based on the national standard of GB 4789.5—2012,comparison among the detection effects of four common culture medium for isolatingShigellawas made.Through the comparison of four isolation medium forShigella flexneriandShigella sooneion recovery rate,limit of detection and detection effect,the detection effect of four media were evaluated.The results showed that the four media had the similar minimum detection limits,and the Chromogenic media 01 demonstrated better specificity in isolation than the other three.The pathogen isolation and culture conditions should be determined and chosen flexibly based on the property of the sample,in order to improve the accuracy and efficiency of detection.

Shigella flexneri;Shigella soonei;chromogenic media;detection effect comparison

R378.2

A

0254-5071（2014）03-0113-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.027

2014-01-05

國家級質檢公益行業(yè)科研專項項目（201210128）

王建昌（1981-），男，博士，主要從事食品微生物、進出境動物及動物產品檢測工作。