大孔樹脂法純化陜產(chǎn)重樓總皂苷工藝研究

張麗華，孫婷，王昌利，宋逍，趙鵬*

（陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西咸陽712046）

大孔樹脂法純化陜產(chǎn)重樓總皂苷工藝研究

張麗華，孫婷，王昌利，宋逍，趙鵬*

（陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西咸陽712046）

研究陜產(chǎn)重樓中總皂苷利用大孔吸附樹脂純化的最優(yōu)工藝。應(yīng)用7種大孔吸附樹脂吸附重樓中的總皂苷進(jìn)行靜態(tài)實驗，篩選得到最佳樹脂；通過動態(tài)實驗確定最佳樹脂對重樓總皂苷的純化的最優(yōu)工藝參數(shù)。結(jié)果表明，HPD-400A樹脂純化重樓總皂苷的效果最優(yōu)，最優(yōu)工藝條件為上樣液質(zhì)量濃度5mg/mL，上樣量8BV，流速3BV/h，解吸流速2BV/h，解吸劑體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇，洗脫劑用量4BV，按此工藝條件制備的重樓總皂苷的含量為62.68%；Freundlich等溫吸附模型可更好的描述樹脂對重樓總皂苷的吸附，采用HPD-400A樹脂分離純化陜產(chǎn)重樓中的總皂苷效果較好。

重樓；總皂苷；大孔吸附樹脂；純化

重樓是百合科植物七葉一枝花（Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara）的干燥根莖[1]，陜產(chǎn)重樓又名金線重樓、螺螄七、七葉一枝花等，是著名的“太白七藥”之一。陜產(chǎn)重樓具有清熱解毒、消腫止痛等功效，主要用于治療各種瘡毒、癰疽等癥[2-6]。研究表明，陜產(chǎn)重樓中的皂苷類化合物是其活性成分之一，目前采用傳統(tǒng)的乙醇水溶液加熱浸提得到的重樓總皂苷，純度較低，不能滿足其進(jìn)一步藥理研究的需要，因此有必要對其進(jìn)行純化工藝研究。

大孔吸附樹脂為一種選擇性有機高聚吸附劑，具有吸附快、解吸快、吸附容量大、易于再生、使用壽命長等優(yōu)點。近年來已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離與富集，尤其適用于水溶性化合物，如皂苷、黃酮等活性成分的分離與富集[7-9]，但在陜產(chǎn)重樓總皂苷純化工藝方面的研究相對較少。本研究重點探討大孔吸附樹脂富集、純化陜產(chǎn)重樓總皂苷的工藝條件和參數(shù)，最終確立了富集、純化的工藝路線，為進(jìn)一步拓寬陜產(chǎn)重樓藥材資源的藥用途徑提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陜產(chǎn)重樓：市售，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院宋逍博士鑒定為陜產(chǎn)百合科植物七葉一枝花[Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara]的干燥根莖；

薯蕷皂苷元：中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸等均為分析純試劑：天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；NKA-9型大孔樹脂：南開大學(xué)樹脂廠；HPD-400A、HPD-100A型大孔樹脂：滄州寶恩化工有限公司；D101、LS-303、LS-45、LS-21型大孔樹脂：西安藍(lán)深特種樹脂有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U-3010 Spectrophotometer紫外可見分光光度計：日本日立公司；CHA-S型氣浴恒溫振蕩器：江蘇金壇市宏華儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 陜產(chǎn)重樓總皂苷的制備

將陜產(chǎn)重樓的根莖在80℃條件下干燥，粉碎后過60目篩。粉碎后的樣品用石油醚回流脫脂2次，過濾，濾渣晾干后，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，按料液比1∶10（g/mL）在75℃條件下浸提2h，共提取3次，提取液合并后濃縮得粗提物浸膏，雙蒸水復(fù)溶得總皂苷粗提物水溶液[10]。

1.3.2 總皂苷含量的測定

[11]檢測方法，并稍加調(diào)整。準(zhǔn)確移取0.2mg/mL的薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，分別加入7支試管中，水浴蒸干溶劑，再加入體積分?jǐn)?shù)5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，在60℃加熱10min后，再冷卻至室溫，加入4mL冰醋酸，振蕩均勻，在波長457nm處平行測定3次吸光度值，以平均值A(chǔ)作縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程A=0.019 6C-0.0078，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，樣品在0.004～0.040mg/mL范圍內(nèi)線性良好。以上述操作方法測試樣品，測得的吸光度值帶入回歸方程求樣品中的總皂苷含量。總皂苷提取率計算公式：

1.3.3 大孔樹脂預(yù)處理

將大孔吸附樹脂用無水乙醇在室溫條件下密封浸泡24h，用蒸餾水洗至洗出液加蒸餾水不顯渾濁為止。然后用1mol/L NaOH溶液浸泡8h，蒸餾水洗至中性，再用1mol/L鹽酸浸泡8h，用蒸餾水洗至中性。

1.3.4 吸附解吸的測定方法[12]

精密稱取1.0g預(yù)處理后的樹脂加到錐形瓶中，加入50mL質(zhì)量濃度約為2.5mg/mL的重樓總皂苷粗品溶液。在恒溫恒速條件下振蕩10h（25℃、120 r/min）達(dá)到吸附平衡，此時測定平衡溶液中皂苷的質(zhì)量濃度。將達(dá)到吸附平衡后的樹脂濾出，加入錐形瓶中，加入50mL體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇，再振搖6h后測定洗脫液中的皂苷濃度。吸附量（mg/g）、解吸量（mg/g）、吸附率和解吸率分別按下式計算：

吸附量＝V1（C0-C1）/m

吸附率=[V1（C0-C1）/m]×100%

解吸量＝C2V2

解吸率=[C2V2/（C0-C1）V1]×100%

式中：C0、C1、C2分別為起始溶液質(zhì)量濃度、吸附平衡時溶液中的總皂苷質(zhì)量濃度、洗脫液質(zhì)量濃度，mg/mL；V1、V2分別為被吸附溶液體積、洗脫溶液體積，mL；m為樹脂質(zhì)量，g。

1.3.5 大孔吸附樹脂的選擇

將選用的NKA-9、D101、HPD400A、HPD-100A、LS-303、LS-45和LS-21型大孔樹脂分別按1.3.4中所述的方法進(jìn)行靜態(tài)吸附、解吸實驗，比較其吸附量和解吸率，選出用于純化總皂苷的大孔樹脂。

1.3.6 等溫吸附曲線測定

準(zhǔn)確稱取1.0g確定好的樹脂于錐形瓶中，加入50mL不同質(zhì)量濃度的重樓總皂苷溶液，放到恒溫?fù)u床上振搖至吸附平衡后，分別測其上清液中總皂苷的質(zhì)量濃度[13]。

1.3.7 動態(tài)吸附、解吸實驗[14]

用20mm×600mm吸附柱，將選定的大孔吸附樹脂，按徑高比1∶10濕法裝柱，加入一定量的總皂苷樣品液，控制流速，吸附一定時間后，測定流出液的皂苷質(zhì)量濃度，以確定吸附率。再用去離子水沖柱，去除雜質(zhì)，最后加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定總皂苷含量以確定解吸率，以此來確定陜產(chǎn)重樓總皂苷的樹脂純化工藝。泄漏率、轉(zhuǎn)移率、解吸率和洗脫率分別按下式計算：

泄漏率=A2/A0

轉(zhuǎn)移率=（A0-A2）/A0

解吸率=洗脫率=A2/（A0-A1）

式中：A0、A1、A2分別為起始溶液中、吸附平衡時溶液中、洗脫液中總皂苷在波長457nm處的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂的篩選

在靜態(tài)條件下以NKA-9、D101、HPD-400A、HPD-100A、LS-303、LS-45和LS-21型大孔樹脂等7種型號的大孔吸附樹脂對陜產(chǎn)重樓總皂苷進(jìn)行吸附和解吸實驗的結(jié)果如表1所示。

表1 不同型號大孔吸附樹脂對總皂苷的吸附解吸性能Table 1 Absorption and desorption performance of different types of macroporous resin for total saponins

由表1可知，其他樹脂的吸附量和解吸率都較小，相比較而言，HPD-400A型大孔吸附樹脂對陜產(chǎn)重樓總皂苷既有較好的吸附量，而且解吸率也較高。因此，在后續(xù)的研究中確定HPD-400A型大孔吸附樹脂作為研究對象。

2.2 吸附等溫線

本研究分別測定了在298K、308K、318K條件下HPD-400A型大孔吸附樹脂對陜產(chǎn)重樓總皂苷的吸附等溫線[15]，再分別對上述數(shù)據(jù)利用Langmuir吸附等溫方程和Freundlich吸附等溫方程（Qe=KFCen，將其寫成線性方程的形式為lnQe=nlnCe+lnKF）進(jìn)行擬合研究。其中：Qe是平衡吸附量，mg/g；Ce是平衡質(zhì)量濃度，mg/L；Qm是飽和吸附量，mg/g；KL是結(jié)合常數(shù)，L/mg；KF和n是等溫吸附的特征常數(shù)。擬合結(jié)果見表2。

表2 等溫方程擬合結(jié)果Table 2 Fitting results of isotherm equation

從表2擬合的等溫吸附模型結(jié)果來看，F(xiàn)reundlich擬合方程的相關(guān)系數(shù)R值大于0.95，說明用此方程來描述HPD-400A型大孔吸附樹脂對陜產(chǎn)重樓總皂苷的吸附特征比較準(zhǔn)確。此外隨著實驗溫度的升高，HPD-400A型大孔吸附樹脂對陜產(chǎn)重樓總皂苷的吸附能力逐漸升高，平衡吸附量也逐漸增加，說明該過程是一個吸熱過程，提高操作溫度，有利于吸附的進(jìn)行。此外，擬合模型的等溫吸附特征常數(shù)n值位于0.1～0.5之間，說明從吸附的強度上來考慮，該吸附過程是個“優(yōu)惠吸附”過程。較大的KL值則表明該吸附過程的吸附力較強，可判斷該吸附過程可能包含了化學(xué)吸附作用[15]。

2.3 動態(tài)吸附及解吸的最佳條件

2.3.1 最大上樣量的確定

按1.3.7操作方法所述，用預(yù)處理好的HPD-400A型大孔吸附樹脂裝柱（樹脂濕質(zhì)量50g，體積約為63mL）將總體積為1 000mL，總皂苷初始質(zhì)量濃度約為5mg/mL的樣品加入到層析柱中，控制吸附流速為3BV/h，根據(jù)動態(tài)吸附實驗來確定吸附柱的穿透曲線，實驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 重樓總皂苷的泄漏曲線圖Fig.1 Leakage curve of total saponin ofParis polyphylla

由圖1可知，在柱流速為3BV/h，上樣量為9BV時，樹脂已發(fā)生了明顯的泄漏現(xiàn)象，此時樹脂柱吸附總皂苷約為2500mg，樹脂的有效容量為50mg/g。與靜態(tài)條件下的樹脂飽和吸附量88.41mg/g相比，樹脂的有效吸附容量為飽和吸附量的56.55%。這說明動態(tài)條件下，HPD-400A型樹脂對重樓總皂苷也有較好的吸附效果。

2.3.2 上樣流速的確定

按1.3.7操作方法所述，HPD-400A型大孔吸附樹脂裝柱（樹脂濕質(zhì)量50g，體積約為63mL）裝5根層析柱，再將總體積為8BV，總皂苷初始質(zhì)量濃度約為5mg/mL的樣品液加入到層析柱中，控制流速為分別按2BV/h、3BV/h、4BV/h、5BV/h、6BV/h進(jìn)行動態(tài)吸附，上樣結(jié)束后，再用4BV的體積分?jǐn)?shù)90%的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫流速為2BV/h，收集洗脫液，測定其總皂苷的量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 上樣流速考察結(jié)果Fig.2 Result of sample flow rate

從圖2可知，當(dāng)吸附流速為2BV/h、3BV/h時，HPD-400A型大孔吸附樹脂對重樓總皂苷的轉(zhuǎn)移率均為90%左右，考慮到操作的經(jīng)濟性，因此選擇3BV/h為最佳上樣流速。

2.3.3 解吸劑體積分?jǐn)?shù)對解吸效果的影響

考慮到解吸效率、溶劑安全性、價廉等，本研究選擇乙醇溶液作為解吸溶劑，在總皂苷上樣量為8BV，洗脫劑用量4BV，流速為2BV/h的條件下，考察體積分?jǐn)?shù)分別為60%、65%、70%、75%、80%乙醇的解吸效果，結(jié)果見圖3。

圖3 解吸劑體積分?jǐn)?shù)對皂苷解吸效果的影響Fig.3 Effect of desorption agent concentration on desorption ratio of saponins

由圖3可知，重樓總皂苷的解吸率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而逐漸增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到75%時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，解吸率的變化并不大，從經(jīng)濟性上來考慮，因此上柱洗脫采用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液作為重樓總皂苷的洗脫劑。

2.3.4 洗脫劑流速對解吸效果的影響

在總皂苷上樣量為8BV，洗脫劑為4BV，洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%的條件下，考察洗脫流速分別為1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、5BV/h對解吸效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 解吸劑流速對皂苷解吸效果的影響Fig.4 Effect of desorption agent velocity on desorption ratio of saponins

由圖4可知，隨著洗脫流速的加大，解吸率逐漸降低。由此可知，流速越慢，總皂苷就被洗脫得越完全，但是耗時過長，綜合考慮，確定洗脫流速以2BV/h為宜。

2.3.5 洗脫劑用量對解吸率的影響

在總皂苷上樣量為8BV，洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%的條件下，洗脫流速為2BV/h，考察洗脫劑用量分別為2BV、3BV、4BV、5BV、6BV對解吸效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 解吸劑用量對皂苷解吸效果的影響Fig.5 Effect of different of desorption agent volume on desorption ratio of saponins

由圖5可以知，隨著洗脫劑用量的加大，洗脫率逐漸升高，當(dāng)洗脫劑到達(dá)4BV時，洗脫率基本上不再改變，考慮到經(jīng)濟性，選擇洗脫劑的用量為4BV。

2.4 純化工藝驗證

按照以上確定的條件，選擇HPD-400A型大孔吸附樹脂裝柱，柱徑高比為1∶10，上樣液質(zhì)量濃度約為5mg/mL，上樣量為8BV，流速為3BV/h，解吸流速2BV/h，解吸劑為體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇，洗脫劑用量為4BV。按此工藝條件制備的重樓總皂苷的含量為62.68%，而未經(jīng)純化前的粗品總皂苷含量為11.02%，這說明經(jīng)過大孔樹脂純化后，純度大幅度提高，達(dá)到國家5類新藥[1]有效成分含量大于50%的含量要求。

3 結(jié)論

通過實驗研究，綜合考慮7種不同大孔樹脂的吸附量和解吸率兩方面的因素，篩選出HPD-400A型大孔吸附樹脂作為純化陜產(chǎn)重樓總皂苷的樹脂。通過對HPD-400A型大孔吸附樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附實驗發(fā)現(xiàn)，可以用Freundlich方程來描述HPD-400A型大孔吸附樹脂對陜產(chǎn)重樓總皂苷的吸附特征，擬合相關(guān)系數(shù)R值大于0.95。該過程是一個吸熱過程，提高操作溫度，有利于吸附的進(jìn)行。

通過動態(tài)實驗，優(yōu)化了HPD-400A型大孔吸附樹脂純化陜產(chǎn)重樓總皂苷的最佳工藝條件為柱徑高比為1∶10，上樣液質(zhì)量濃度5mg/mL，上樣量8BV，流速3BV/h，解吸流速2BV/h，解吸劑體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，洗脫劑用量4BV。按此工藝條件制備的重樓總皂苷的含量為62.68%，收率為57.42%。

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Purification of total saponins in ShaanxiParis polyphyllaby macroporous adsorptive resins

ZHANG Lihua,SUN Ting,WANG Changli,SONG Xiao,ZHAO Peng*
(School of Pharmacy,Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712046,China)

An optimal macroporous adsorption resin and its optimal technological parameters for purification of saponins from extracts of Shaanxi Paris polyphyllawere investigated.Seven resins were used to purify the saponin through the static method.The optimal technology for purifying total saponins was determined by the selected resin through dynamic experiments.HPD-400A resin was chosen due to its excellent adsorption and desorption performance.The optimal conditions were primarily confirmed as follows:concentration of sample solution 5 mg/ml,loading amount 8 BV and the adsorption flow rate 3 BV/h;then eluted with 75%vol alcohol for 4 BV with 2 BV/h.Under the above conditions,the yield of saponins reached up to 62.68%.Freundlich model could better describe the resin absorption of total saponins fromP.polyphylla,and the effect of HPD-400 resin for purifying total saponins fromP.polyphyllawas good.

Paris polyphylla;total saponin;macroporous adsorptive resins;purification

R283.6

A

0254-5071（2014）03-0100-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.024

2014-01-24

陜西省教育廳重點實驗室資助項目（09JS014）

張麗華（1979-），女，講師，碩士，研究方向為天然藥用活性成分分離純化。

*通訊作者：趙鵬（1977-），男，副教授，博士，研究方向為天然藥用活性成分分離純化。