枯草芽孢桿菌C3產抗菌物質發(fā)酵條件優(yōu)化

楊永青，謝遠紅，張紅星，熊利霞，馬曉丹，劉慧*，孔保華

（1.北京農學院食品科學與工程學院，北京102206；2.農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，食品質量與安全北京實驗室，北京102206；3.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

枯草芽孢桿菌C3產抗菌物質發(fā)酵條件優(yōu)化

楊永青1，2，謝遠紅1，2，張紅星1，2，熊利霞1，2，馬曉丹1，2，劉慧1，2*，孔保華3

（1.北京農學院食品科學與工程學院，北京102206；2.農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，食品質量與安全北京實驗室，北京102206；3.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

利用篩選的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）C3研究提高產抗菌物質的發(fā)酵條件。通過測定枯草芽孢桿菌C3抗菌物質對黑曲霉孢子萌發(fā)的抑制率，設計6因素3水平正交試驗得到優(yōu)化的發(fā)酵條件為：種子液的菌齡12h，種子液接種量2%，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量75mL/250mL，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.0，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時間48h。在優(yōu)化發(fā)酵條件下，枯草芽孢桿菌C3產抗菌物質的抑菌活性比優(yōu)化前提高了26.52%。

枯草芽孢桿菌；抗菌物質；發(fā)酵條件優(yōu)化

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種公認安全的有益微生物，對人畜無毒害，不污染環(huán)境，其在生長和代謝過程中能產生包括肽類、脂肽類、多烯類、磷脂類、氨基酸類與核酸類等多種抗菌物質，可以抑制霉菌、酵母菌、細菌、病毒等多種微生物的生長，在果蔬保鮮、果實采后病害、植物病害的生物防治方面具有重要應用價值[1-2]。張麗麗等[3]通過試驗證明，枯草芽孢桿菌Sf-19培養(yǎng)原液對梨輪紋病菌菌絲生長的平板抑制率為87.33%，孢子萌發(fā)的抑制率為97%；黃曦等[4]研究發(fā)現，枯草芽孢桿菌ON-6菌株能抑制荔枝炭疽菌的生長；李永剛等[5]研究發(fā)現，枯草芽孢桿菌BS2對葡萄灰霉病菌具有較好的拮抗作用；楊琦瑤等[6]報道枯草芽孢桿菌B006對黃瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌具有一定抑制作用。枯草芽孢桿菌抗菌物質具有較廣譜的抗菌作用，通過優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，提供最適的生長環(huán)境，可以提高抗菌物質的產量與抑菌活性[7-9]。課題組前期試驗優(yōu)化了枯草芽孢桿菌C3產抗菌物質的發(fā)酵培養(yǎng)基，對黑曲霉孢子萌發(fā)的抑制率提高了118.64%[10]。繼而課題組采用6因素3水平正交試驗優(yōu)化產抗菌物質的發(fā)酵條件，以抑制率評價C3菌株抗菌物質對黑曲霉孢子萌發(fā)的抑制活性，旨在提高C3菌株抗菌物質的產量，以便后續(xù)分離純化抗菌物質，為進一步研究其抑菌機理及果蔬保鮮應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

指示菌株：黑曲霉（Aspergillus niger），由食品質量與安全北京實驗室保藏并提供。

試驗菌株：枯草芽孢桿菌C3，由食品質量與安全北京實驗室課題組篩選并保存，經微量生化反應與16s DNA方法鑒定為Bacillus subtilis。

1.1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基[10]：葡萄糖1.0%，蛋白胨1.5%，酵母浸粉1.5%，KH2PO40.1%，NaCl 0.5%，MgSO4·7H2O 0.15%；pH 7.0，0.1MPa高壓滅菌15min。

種子液培養(yǎng)基[11]：葡萄糖1.0%，蛋白胨1.0%，NaCl1.0%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.15%，pH 7.0。

指示菌斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[12]：馬鈴薯（去皮切塊）200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1 000mL，pH自然。

菌落計數培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基內加入0.1%吐溫-80，以及終質量濃度為30.0μg/mL青霉素與鏈霉素混合液（青霉素與鏈霉素的質量比為1∶1）[13]。

1.2 儀器與設備

MLS-3750型全自動高壓蒸汽滅菌鍋：日本SANYO公司；THZ-C-1型臺式冷凍恒溫振蕩器：太倉市實驗設備廠；BS224S型電子天平：德國賽多利斯集團；GHP-9160型恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；BCN-1360B型無菌超凈工作臺：哈爾濱東聯電子技術開發(fā)有限公司；PHS-3B型雷磁便攜式酸度計：上海精科實業(yè)有限公司；0.22μm無菌過濾器：德國賽多利斯集團。

1.3 方法

1.3.1 指示菌懸液制備

無菌超凈臺中將黑曲霉接種于PDA斜面培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48h后，用滅菌生理鹽水洗脫孢子，經4層滅菌紗布過濾得黑曲霉孢子懸液。將黑曲霉孢子懸液按10倍梯度稀釋法制成10-2～10-6梯度黑曲霉孢子稀釋液，4℃冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抗菌物質粗提液制備

枯草芽孢桿菌C3發(fā)酵液4℃10 000r/min離心15min，棄菌體取上清液，用0.22μm細菌過濾器過濾即得到無菌抗菌物質粗提液。

1.3.3 抗菌物質活性的測定

抗菌活性的測定采用菌落計數法[14]。先吸取10-3～10-4濃度黑曲霉孢子稀釋液0.1mL加入菌落計數培養(yǎng)基平板中，涂勻涂布，靜置10min，再取0.1mL抗菌物質粗提液均勻涂布于上述培養(yǎng)基，靜置10min后，28℃培養(yǎng)24～48h，計數霉菌孢子萌發(fā)為菌落的數量，根據孢子萌發(fā)的數量評價抗菌物質的活性。

霉菌孢子萌發(fā)抑制率的計算公式：

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

根據李凜等[16-19]的研究文獻及單因素預試驗結果，選取種子液菌齡、接種量、裝液量、初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間6個影響因素，設計6因素3水平L18（36）正交試驗，如表1所示。根據正交試驗表分別進行發(fā)酵試驗，發(fā)酵結束后調節(jié)發(fā)酵液pH至7.0，測定抗菌物質活性。

表1 發(fā)酵條件正交試驗設計因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for fermentation condition optimization

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗驗證

根據正交試驗優(yōu)化結果，選擇適宜的菌齡、接種量、裝液量、初始pH值、溫度及發(fā)酵時間組合為處理組，對枯草芽孢桿菌產生抗菌物質的效果進行驗證。對照組采用優(yōu)化前的發(fā)酵條件，按1.3.2方法測定抗菌物質活性，同時計算霉菌孢子萌發(fā)抑制率。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

發(fā)酵條件對抗菌物質產量影響優(yōu)化正交試驗結果見表2，正交試驗結果方差分析見表3。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test for fermentation condition optimization

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化的方差分析Table 3 Variance analysis of fermentation conditions optimization

2.1.1 種子液菌齡對抗菌物質產量的影響

微生物產生的代謝產物大多在對數生長期或穩(wěn)定期合成，因此采用對數生長期的種子液進行接種發(fā)酵，有助于縮短生長曲線的遲緩期，并盡快進入對數生長期。枯草芽孢桿菌的抗菌物質主要在對數生長末期、尚未進入穩(wěn)定期時合成。陳雪等[20]研究細菌素的產量與枯草芽孢桿菌生長曲線間的關系，發(fā)現細菌素主要在對數生長期合成。由表2可知，采用不同菌齡的種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基時，枯草芽孢桿菌C3對黑曲霉的抑制活性影響表現為kA3＞kA1＞kA2，即接種發(fā)酵培養(yǎng)基的種子液菌齡為12h時抑菌活性最強，6h次之，9h最小。由此表明種子液菌齡為12h時，正是菌體處于對數生長期的時間，故確定種子液的較優(yōu)菌齡為12h。由表3方差分析可知，采用不同菌齡的種子液接種發(fā)酵，對抗菌物質的抑菌活性影響極顯著（α=0.01）。

2.1.2 接種量對抗菌物質產量的影響

在一定范圍內，較大的接種量更有利于微生物快速進入對數生長期或穩(wěn)定期，但帶入培養(yǎng)基的代謝廢物亦增多，不利于微生物的生長代謝，進而影響抗菌物質的產量。由表2可知，采用不同接種量時，枯草芽孢桿菌C3對黑曲霉的抑制活性表現為kB2＞kB3＞kB1，即接種量為2%時抗菌物質產量最高，接種量為3%時次之，接種量為1%最低。故確定種子液的較優(yōu)接種量為2%。由表3方差分析可知，不同種子液的接種量對抗菌物質的抑菌活性影響顯著（α=0.05）。

2.1.3 裝液量對抗菌物質產量的影響

枯草芽孢桿菌為好氧微生物，故充足的氧氣有利于其生長代謝。裝液量的多少決定發(fā)酵時的通氣量。同時，充足的營養(yǎng)物質有利于枯草芽孢桿菌的快速繁殖，增加產抗菌物質的活菌基數。因此，在一定范圍內調整裝液量比例，可提高枯草芽孢桿菌抗菌物質的合成與積累。由表2可知，采用不同裝液量時，枯草芽孢桿菌C3對黑曲霉的抑制活性表現為kC3＞kC2＞kC1，即裝液量為75mL/250mL時抗菌物質產量最高，50mL/250mL時次之，25mL/250mL時最低。結果表明，裝液量為75mL/250mL時通氣量充足，同時營養(yǎng)物質與通氣量二者對枯草芽孢桿菌抗菌物質產量的影響達到最佳平衡點，此時抗菌物質產量最高。故確定發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為75mL/250mL。由表3方差分析可知，不同發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量對抗菌物質的抑菌活性影響顯著（α=0.05）。

2.1.4 初始pH值對抗菌物質產量的影響

適當的初始pH值有利于微生物的生長及代謝產物的積累。由表2可知，采用不同發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值時，枯草芽孢桿菌C3對黑曲霉的抑制活性表現為kD2＞kD1＞kD3，即初始pH值為7.0時抗菌物質產量最高，pH5.0時次之，pH9.0時最低。這與劉永峰等[21]優(yōu)化枯草芽孢桿菌B916產抗菌物質發(fā)酵條件時的結果一致。故確定發(fā)酵培養(yǎng)基的較優(yōu)初始pH值為7.0。由表3方差分析可知，不同發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對抗菌物質的抑菌活性影響極顯著（α=0.01）。

2.1.5 發(fā)酵溫度對抗菌物質產量的影響

溫度是影響微生物生長繁殖最重要的物理因素，適宜的發(fā)酵溫度有利于枯草芽孢桿菌抗菌物質的合成與積累。由表2可知，采用不同發(fā)酵溫度時，枯草芽孢桿菌C3對黑曲霉的抑制活性為kE2＞kE1＞kE3，即37℃時抗菌物質產量最高，34℃時次之，40℃時最低。故確定37℃為較優(yōu)的發(fā)酵溫度。由表3方差分析可知，不同發(fā)酵溫度對抗菌物質的抑菌活性無顯著影響。

2.1.6 發(fā)酵時間對抗菌物質產量的影響

微生物代謝產物的積累是一個復雜的動態(tài)過程，在不同發(fā)酵時間積累的代謝產物各不相同；同時，不同代謝產物出現的最大積累量的時間亦不同。在發(fā)酵過程的某一時刻，目的代謝產物會有最大的積累量。由表2可知，采用不同發(fā)酵時間時，枯草芽孢桿菌C3對黑曲霉的抑制活性表現為kF2＞kF1＞kF3，即發(fā)酵時間為48h時抗菌物質產量最高，24h時次之，72h時最低。故確定48h為較優(yōu)的發(fā)酵時間。由表3方差分析可知，不同發(fā)酵時間對抗菌物質的抑菌活性影響顯著（α=0.05）。

由表2中極差R值分析可知，以枯草芽孢桿菌拮抗霉菌孢子萌發(fā)生長的黑曲霉菌落數為指標，則RA（菌齡）＞RD（初始pH值）＞RC（裝液量）＞RF（時間）＞RB（接種量）＞RE（溫度），又由表3方差分析可知，菌齡、接種量、裝液量、初始pH值、時間對枯草芽孢桿菌抗菌物質產量均有顯著影響（α=0.05），其中種子液菌齡和發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對枯草芽孢桿菌抗菌物質產量有極顯著影響（α=0.01），即菌齡影響最顯著，其次是初始pH值、裝液量、發(fā)酵時間、接種量，影響最小的是發(fā)酵溫度。枯草芽孢桿菌產抗菌物質發(fā)酵條件的最優(yōu)組合為A3B2C3D2E2F2，即種子液菌齡12h，種子液接種量2%，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量75mL/250mL，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.0，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時間48h。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗驗證

表4 發(fā)酵條件優(yōu)化前后的結果對比Table 4 Comparison of fermentation result before and after optimization

由表4可知，采用優(yōu)化組合條件對枯草芽孢桿菌進行發(fā)酵，所產抗菌物質可將黑曲霉孢子萌發(fā)數量由未優(yōu)化前的6.90×106CFU/mL降低至優(yōu)化后的5.07×106CFU/mL，對黑曲霉的抑制率提高了26.52%，抗菌活性明顯提高，表明采用優(yōu)化發(fā)酵條件可以較大增加枯草芽孢桿菌抗菌物質的產量。

3 結論

不同發(fā)酵條件對枯草芽孢桿菌C3抗菌物質的產量有明顯影響。其中種子液菌齡和發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對枯草芽孢桿菌C3抗菌物質產量影響極顯著（α=0.01），接種量、裝液量、發(fā)酵時間對枯草芽孢桿菌C3抗菌物質產量影響顯著（α=0.05），而發(fā)酵溫度對枯草芽孢桿菌C3抗菌物質產量無顯著影響。即影響枯草芽孢桿菌抗菌物質產量的主次順序為：種子液菌齡＞初始pH＞裝液量＞時間＞接種量＞溫度。

采用菌落計數法以抑制率評價C3菌株抗菌物質對黑曲霉孢子萌發(fā)的抑制活性，通過正交試驗得到優(yōu)化發(fā)酵條件為種子液的菌齡12h，種子液接種量2%，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量75mL/250mL，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.0，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時間48h。在優(yōu)化發(fā)酵條件下，枯草芽孢桿菌C3產抗菌物質的抑菌活性比優(yōu)化前提高了26.52%。

[1]張彩霞，李壯，康國棟，等.枯草芽孢桿菌防治果實采后病害的研究進展[J].果樹學報，2009，26（5）：699-703.

[2]楊潔.枯草芽孢桿菌E1R-j產抗菌脂肽的發(fā)酵條件優(yōu)化及分離純化[D].楊凌：西北農林科技大學碩士論文，2012.

[3]張麗麗，常有宏，丁芳兵，等.2株枯草芽孢桿菌對梨輪紋病菌的室內抑制作用研究[J].果樹學報，2010，27（5）：823-827.

[4]黃曦，張榮燦，王何健.枯草芽孢桿菌ON-6菌株抑制荔枝炭疽菌活性物質的初步研究[J].中國農學通報，2011，27（13）：188-193.

[5]李永剛，郭曉慧.枯草芽孢桿菌BS2對葡萄灰霉病菌抑菌機制的初步探索[J].微生物學通報，2010，37（5）：721-725.

[6]楊琦瑤，索雅麗，郭榮君.枯草芽孢桿菌B006對黃瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的抑制作用及其抗菌組分分析[J].中國生物防治學報，2012，28（2）：235-242.

[7]孫亮，劉文波，楊廷雅，等.枯草芽孢桿菌HAB-1產生抗菌物質的最優(yōu)發(fā)酵條件[J].熱帶生物學報，2013，4（3）：225-230.

[8]南楠，戚向陽，袁勇軍，等.枯草芽孢桿菌WL17產抗菌物質的發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J].中國食品學報，2011，11（6）：77-83.

[9]陳瓊珍，吳興泉.枯草芽孢桿菌對有害真菌的生防作用及最佳發(fā)酵條件研究[J].河南工業(yè)大學學報：自然科學版，2011，32（5）：66-70.

[10]馬曉丹，張紅星，劉慧，等.枯草芽孢桿菌C3產抗菌物質發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國釀造，2012，31（5）：10-14.

[11]高學文，姚仕義.枯草芽抱桿菌B2菌株產生的抑菌活性物質分析[J].中國生物防治，2003，19（4）：175-179.

[12]高學文，姚仕義，HUONG P，等.枯草芽抱桿菌B2菌株產生的表面活性素變異體的純化和鑒定[J].微生物學報，2003，43（5）：647-752.

[13]劉伊強，王雅平，潘乃糙.拮抗菌TG26的鑒定及其抗菌蛋白Bl的純化和部分特性[J].植物學報，1994，36（3）：97-203.

[14]劉慧.現代食品微生物學實驗技術[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2006.

[15]李晶，楊謙，趙麗華，等.生防枯草芽孢桿菌B29菌株抗菌物質的初步研究[J].中國生物工程雜志，2008，28（2）：59-65.

[16]李凜，羅俊成，胡欣潔，等.類細菌素產生菌的篩選及發(fā)酵條件的研究[J].釀酒科技，2005（4）：34-37.

[17]李占杰，李寶慶，鹿秀云，等.生防菌株CAB-1抑菌物質產生的條件及其穩(wěn)定性研究[J].安徽農業(yè)科學，2010，38（11）：5700-5702.

[18]石懷興，尚玉珂，季靜，等.培養(yǎng)條件對枯草芽孢桿菌G8抗菌蛋白含量的影響及蛋白液對黃瓜菌核病的生防效果[J].農藥學學報，2009，11（2）：244-249.

[19]劉林，黃云，劉勇.芽孢桿菌Bs2004菌株的鑒定、抑菌作用及發(fā)酵配方優(yōu)化研究[D].雅安：四川農業(yè)大學碩士論文，2007.

[20]陳雪，侯紅漫，陳莉，等.產細菌素芽孢桿菌的篩選及發(fā)酵條件的研究[J].中國釀造，2008，27（9）：26-30.

[21]劉永鋒，陳志誼，周明國.枯草芽孢桿菌Bs-916的抑菌活性及其抑菌物質初探[J].農藥學學報，2007，9（1）：92-95.

Optimization of fermentation conditions of antibacterial material production byBacillus subtilisC3

YANG Yongqing1,2,XIE Yuanhong1,2,ZHANG Hongxing1,2,XIONG Lixia1,2,MA Xiaodan1,2,LIU Hui1,2*,KONG Baohua3
(1.College of Food Science and Engineering,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China;2.Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue,Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing 102206,China;3.College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The screenedBacillus subtilisC3 was used to study the fermentation conditions of antibacterial material production.By measuring antibacterial material ofB.subtilisC3 on the inhibition rate ofAspergillus nigerspore germination,an orthogonal experiment with 6 factors and 3 levels was conducted to optimize the fermentation condition.The optimum condition was follows:age of inoculums 12 h,inoculums 2%,fermentation medium with fluid volume 75 ml/250 ml,initial pH 7.0,temperature 37℃,fermentation time 48 h.Under the optimized condition,the activities of antibacterial material byB.subtilisC3 increased 26.52%comparing to the non-optimized one.

Bacillus subtilis;antibacterial material;fermentation condition optimization

Q93-335

A

0254-5071（2014）03-0028-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.008

2014-01-27

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD28B02-01）；“十二五”國家高技術研究發(fā)展計劃（863）項目子課題（2012AA101606-05）；北京市教育委員會面上項目（KM201410020010）

楊永青（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物與發(fā)酵。

*通訊作者：劉慧（1963-），女，教授，碩士，研究方向為食品微生物學與功能性發(fā)酵食品。