超臨界CO2流體萃取啤酒糟中色素工藝的研究

姜福佳，呂 爽，逯家富

（長春職業技術學院，吉林長春130033）

隨著社會發展的不斷進步，人們越來越重視健康，天然、綠色食品逐漸被人們青睞，啤酒糟中的色素是一種天然色素，可以作為食品和許多生活用品中的著色劑，并且具有很強的生理活性[1-2]。

啤酒糟是啤酒工業的副產品，其中含有豐富的粗蛋白和色素，營養價值較高。目前，啤酒糟多用來添加到動物的飼料中，沒有使啤酒糟的綜合利用價值得到充分的提高。因此，我們以啤酒糟為原料，提取其中的色素具有重大意義[3-7]。

超臨界流體萃取是一種新型的提取分離技術，它是利用壓力和溫度對超臨界流體溶解能力的影響而對物質進行提取。在超臨界狀態下，將超臨界流體與待分離的物質接觸，使其有選擇性地按極性大小、沸點高低和分子量大小依次將成分萃取出來。然后借助減壓、升溫的方法使超臨界流體變成普通氣體，被萃取物質則完全或基本析出，從而達到分離提純的目的，所以超臨界流體萃取過程是由萃取和分離組合而成，從多種液態或固態混合物中萃取出待分離的組分[8-9]。由于響應面分析法精確度高、優化效果好[10]，所以，本研究用超臨界CO2流體萃取法提取色素，在單因素實驗的基礎上，將響應面法應用于超臨界CO2流體萃取色素的工藝優化，以提高色素的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒糟 烘干、粉碎（80目）華潤雪花啤酒長春有限公司；原花色素 河北百味生物科技有限公司；CO2液化氣 純度99.9%以上，長春巨洋氧氣廠；無水乙醇（分析醇） 天津市富宇精細化工有限公司；

鼓風干燥箱 河北黃驊航天儀器廠；多功能粉碎機 上海廣沙工貿有限公司；A221-50-06型CO2超臨界萃取裝置 江蘇南通華安超臨界有限公司；UV-2401 PC型紫外可見分光光度計 島津公司；721型紫外分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗

1.2.1.1 萃取溫度對色素含量的影響 稱取啤酒糟100g，裝入萃取釜中，在萃取溫度分別為25、30、35、40、45、50、55℃的條件下，按萃取壓力30MPa（分離Ⅰ、分離Ⅱ溫度和壓力分別為30℃、9MPa和30℃、6MPa），CO2流量為25L/h萃取啤酒糟90m in，收集色素，測定吸光度，計算色素含量。

1.2.1.2 萃取壓力對色素含量的影響 稱取啤酒糟100g，裝入萃取釜中，在萃取溫度40℃，萃取壓力分別為10、15、20、25、30、35MPa（分離Ⅰ、分離Ⅱ溫度和壓力分別為30℃、9MPa和30℃、6MPa），CO2流量為25L/h的條件下萃取啤酒糟90min，收集色素，測定吸光度，計算色素含量。

1.2.1.3 CO2流量對色素含量的影響 稱取啤酒糟100g，裝入萃取釜中，在萃取溫度40℃，萃取壓力30MPa（分離Ⅰ、分離Ⅱ溫度和壓力分別為30℃、9MPa和30℃、6MPa），CO2流量分別為10、15、20、25、30、35、40L/h的條件下萃取啤酒糟90min，收集色素，測定吸光度，計算色素含量。

1.2.1.4 萃取時間對色素含量的影響 稱取啤酒糟100g，裝入萃取釜中，在萃取溫度40℃，萃取壓力30MPa（分離Ⅰ、分離Ⅱ溫度和壓力分別為30℃、9MPa和30℃、6MPa），CO2流量25L/h的條件下，分別對啤酒糟萃取60、90、120、150、180、210m in，收集色素，測定吸光度，計算色素含量。

1.2.2 啤酒糟色素提取物的紫外-可見分析圖譜 將實驗所提取的色素稀釋，在紫外可見光區波長200～ 800nm下進行檢測，結果顯示，物質在280nm下有最大吸收峰，說明物質中含原花色素的某些成分。色素提取物的紫外分析圖譜見圖1。

圖1 色素提取物的紫外分析圖譜Fig.1 The pigmentextractuvmap analysis

圖2 標準曲線Fig.2 The standard curve

1.2.3 標準曲線的制作 稱取10mg原花色素，配制成0.1mg/m L濃度的標準溶液，分別吸取1、2、3、4、5、6m L，在10m L的棕色容量瓶中定容，所得色素的濃度分別是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg／m L。放入冰箱中平衡0.5h，用無水乙醇作為空白液，用紫外分光光度計在280nm處測其吸光度值。結果用最小二乘法做線性回歸，得標準曲線圖，見圖2。得到的標準曲線方程為：

式中：A—吸光度值；X—原花色素的濃度（mg/m L）。

1.2.4 色素含量的測定 超臨界CO2流體萃取出啤酒糟中的色素后，將萃取物離心分離，分離除去脂肪等雜質，得到色素。吸取色素50μL，定容至5m L，在280nm下測定吸光度，計算色素含量[11]。

色素含量（μg/g）=C280×V×稀釋倍數/E×M

式中：C280—為色素在280吸光度下的濃度（mg/m L）；V—為樣品溶液的總體積（m L）；E—為色素在無水乙醇中百分消光系數，2348；M—啤酒糟質量（g）。

1.2.5 響應面法優化色素提取的最佳工藝方法 本實驗針對影響超臨界萃取效果的主要因素——萃取溫度、萃取壓力、CO2流量以及萃取時間進行單因素實驗，在單因素實驗的基礎上，確定最佳的萃取時間，然后利用三因素三水平響應面分析方法對啤酒糟中色素的提取條件進行優化。依據最佳提取條件進行驗證實驗。響應面分析因素與水平見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table1 Factors and levels of RSM analysis

2 結果與討論

2.2 單因素實驗

2.2.1 萃取溫度對色素含量的影響結果 實驗結果如圖3所示。由圖3我們可以看出，萃取溫度對色素含量的影響顯著，啤酒糟中的色素含量隨著萃取溫度的升高而逐漸上升，當萃取溫度為45℃時達到最大，之后色素含量隨溫度的升高逐漸下降，這應該是因為，在一定壓力下，溫度升高，CO2密度降低，溶解能力下降[12]。因此，本實驗所得的最佳萃取溫度是45℃。

圖3 萃取溫度對色素含量的影響Fig.3 Effectof content temperature on pigment production rate

2.1.2 萃取壓力對色素含量的影響結果 實驗結果如圖4所示，由圖4我們可以看出，隨著萃取壓力的增加，色素的含量逐漸增大，當壓力為30MPa時，色素的含量最高，當萃取壓力高于30MPa后，色素的含量有所下降，這應該是因為，溫度一定時，壓力增大，超臨界流體密度增大，對溶質的溶解能力越大，萃取趨于完全。當壓力增至一定程度時，CO2溶解能力增加緩慢，色素的收率增加不大甚至降低[11]，因此，本實驗中最佳萃取壓力為30MPa。

圖4 萃取壓力對色素含量的影響Fig.4 Effect of content pressure on pigment production rate

2.1.3 CO2流量對色素含量的影響結果 實驗結果如圖5所示。由圖5我們可以看出，隨著CO2流量的升高，色素含量逐漸增大，當CO2流量為30L/h時，色素含量最高，然后隨著CO2流量的繼續升高，色素的含量有所下降，主要是由于CO2流量的增加提高了傳質速率，增大萃取能力，提高了萃取效率，從而縮短萃取時間。萃取后期，由于萃取對象中待分離組分含量減少，故萃取量又降低。同時，CO2流量過大會導致CO2停留時間過短，反而使色素含量降低[13]，因此，通過實驗，我們確定最佳CO2流量是30L/h。

圖5 CO2流量對色素含量的影響Fig.5 Effect of CO2 flow rate on pigment production rate

2.1.4 萃取時間對色素含量的影響結果 實驗結果如圖6所示。由圖6我們可以看出，隨著萃取時間的延長，色素的含量逐漸增大，當萃取時間為150min時，色素的含量最高，隨著萃取時間的繼續增加，色素含量的增加幅度減小，近于平衡[14]，因此，最佳的萃取時間為150m in。

2.2 響應面法優化色素提取的最佳工藝結果

在單因素實驗的基礎上，我們確定最佳萃取時間為定量150min，以萃取溫度、萃取壓力、CO2流量三個因素作為自變量，以色素含量為響應值，設計三因素三水平的分析實驗。實驗設計方案及實驗結果見表2。

圖6 萃取時間對色素含量的影響Fig.6 Effectof content time on pigment production rate

表2 響應面分析方案及實驗結果Table2 The experiment design and results of RSM

采用多元二次回歸方程擬合實驗結果，再用F檢驗統計分析工具和響應面圖研究考察因子之間的交互關系及因子與響應值間的關系。最后采用導數求極值法求得色素提取的最優條件。

對表2中數據進行回歸分析，獲得色素含量對編碼自變量萃取溫度、萃取壓力和CO2流量的二次多項回歸方程：

回歸分析結果見表3，其響應面圖見圖7。通過SAS軟件對實驗數據的分析，得R2為97.81%，說明回歸方程可以較好地描述考察因子與響應值之間的關系。根據p值可以看出，萃取溫度對色素含量的影響高度顯著，失擬項不顯著（p＞0.05），一次項X1、X2、X3，二次項X、X1X2、X、X均顯著，說明它們對響應值影響較大。根據F值，我們可以判斷影響色素含量大小的順序依次為：萃取溫度＞萃取壓力＞CO2流量。

表3 回歸分析結果Table3 The results of regression analysis

圖7 （a）Y=f（X1，X2），（b）Y=f（X1，X3）和（c）Y=f（X2，X3）的響應面圖Fig.7 Responsive surface graphs of（a）Y=f（X1，X2），（b）Y=f（X，X）and（c）Y=f（X，X）

圖7直觀地描繪出影響因素間交互作用的響應面曲面圖。由圖7響應面的最高點和等高線我們可以看出，在所選的范圍存在極值，即響應面的最高點與等高線的中心點重合，圖7（a）表明，X1和X2交互作用顯著，X1較大的同時X2減小，Y值便會減小，即萃取溫度升高，萃取壓力降低，導致色素的含量降低，這可能是由于溫度升高后，CO2密度降低，溶解能力下降，壓力同時減小，所以色素的含量降低。SAS軟件系統給出了能夠得到最大響應值的X1、X2、X3分別為X1= 46.3、X2=30.7、X3=29.5。即當萃取溫度46.3℃，萃取壓力30.7MPa，CO2流量為29.5L/h時色素含量最高，為67.2μg/g。

2.3 驗證實驗

我們進一步修改了響應面優化所得的最佳工藝參數，修整為萃取溫度45℃，萃取壓力30MPa，CO2流量30L/h，做三組平行的超臨界CO2萃取實驗，三組平行實驗的色素含量分別是66.3、64.8、66.7μg/g，平均含量為65.9μg/g，與理論值的相對誤差為1.9%，因此，模型能較好地預測色素的含量。

3 結論

本研究在單因素實驗的基礎上，利用響應面法優化影響色素含量的三種因素：萃取溫度、萃取壓力和CO2流量，通過回歸分析，我們得到萃取溫度對色素含量的影響高度顯著，同時，通過多元二次回歸方程得出最優的提取條件，即萃取溫度45℃，萃取壓力30MPa，CO2流量30L/h，最終所得啤酒糟中色素含量為65.9μg/g。本次實驗，我們不僅得到了色素，同時除去了干啤酒糟中所含有的大量脂肪，為進一步提取蛋白質等活性物質奠定了基礎。

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