核桃乳(露)飲品中花生、大豆成分的PCR檢測(cè)方法

魏曉璐，黃 鑫，馮 悅，張阿梅，夏雪山，劉 麗

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500)

核桃主要由脂肪和蛋白質(zhì)組成［1］，核桃蛋白因具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而被越來越多的應(yīng)用到食品生產(chǎn)中。核桃乳(露)飲料憑借其純天然的植物蛋白原材料、不失核桃仁原有營(yíng)養(yǎng)成份、增強(qiáng)大腦記憶功能［2］等特點(diǎn)為大眾所喜愛。不法商家為謀取私利，采用價(jià)格低廉的花生或大豆為原材料仿造核桃乳(露)飲料并以低價(jià)爭(zhēng)搶市場(chǎng)。這種食品摻假行為嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者的合法權(quán)益，不僅欺騙了消費(fèi)者，也會(huì)危害對(duì)花生和大豆過敏的消費(fèi)者。現(xiàn)行植物蛋白飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 16322－2003)注明以核桃仁以外的原料制成的飲品不符合核桃乳(露)定義標(biāo)準(zhǔn)［3］。植物蛋白飲料－核桃乳(露)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(QB/T 2301－1997)以物理和化學(xué)方法對(duì)核桃乳(露)的感官、凈含量和各種理化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)［4］，但無法對(duì)其中是否摻入其他植物蛋白做出判斷。為保證核桃乳(露)飲品質(zhì)量和保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，有必要建立檢測(cè)核桃乳(露)飲品中摻雜其他植物蛋白的方法。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)食品中植物成分殘留以及植物蛋白的檢測(cè)研究主要集中在ELISA、普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方面［5－11］，在食品鑒偽相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［12－18］中，沒有對(duì)核桃乳(露)中摻入花生或大豆進(jìn)行快速鑒別的有效方法。本研究針對(duì)花生特異性過敏基因Arah 1以及大豆特異性過敏基因Gly m Bd28 K設(shè)計(jì)引物，建立了核桃乳(露)中花生、大豆成分的PCR檢測(cè)方法。旨在為核桃乳(露)中摻入大豆、花生成分的檢測(cè)提供快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的方法依據(jù)，為保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益、規(guī)范保健食品研制和生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)提供有力的技術(shù)支持和技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃大豆、青大豆、黑大豆、黑小豆、扁豆、綠豆、蠶豆、白蕓豆、紅蕓豆、豌豆、麻豇豆、豇豆、紅小豆、赤豆、腰果、核桃、花生、燕麥、香蕉、白芝麻、榛子、碧根果、蘋果、開心果;瓜子;黑芝麻;杏仁;松子市售不同品牌核桃乳(露)飲品22種 購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;PCR儀 購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司;電泳儀 購(gòu)自美國(guó)Biorad公司;凝膠成像儀 購(gòu)自美國(guó)UVP公司;500bp ladder DNA marker、2000bp ladder DNA marker 購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;2×Prem ix Taq 購(gòu)自TAKARA生物有限公司;離心柱型植物基因組DNA提取試劑盒(目錄號(hào):DP305) 購(gòu)自天根公司。

表1 PCR引物序列Table1 Sequence of PCR primer

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件Table2 PCR reaction condition

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取 固體樣品經(jīng)液氮研磨成粉末后取100mg，液體樣品經(jīng)冷凍干燥后取粉末100mg，分別加入1.5m L離心管中。使用天根公司離心柱型植物基因組提取試劑盒提取DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)不同物種具有各自特異的基因，從Genbank數(shù)據(jù)庫下載花生過敏基因(Arah 1)序列、大豆過敏基因(Gly m Bd28 K)序列。通過Mega軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，利用Oligo軟件，設(shè)計(jì)一對(duì)花生特異性引物Arah 1－F/R、一對(duì)大豆特異性引物Bd 28K－F/R。植物通用引物CP 03、核桃特異性引物WAL－F/R參照文獻(xiàn)［5］。本實(shí)驗(yàn)所有引物序列見表1。引物委托華大基因有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè) PCR擴(kuò)增總體積為25μL，反應(yīng)體系如下:12.5μL 2×Prem ix Taq (TaKaRa)、0.5μL引物(上下游各0.5μL)、1.0μL模板，補(bǔ)雙蒸水到25μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件見表2。

取6μL PCR產(chǎn)物，在已加入溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠和1×TAE緩沖液中電泳20min(120V)。以500bp ladder DNA maker或2000bp ladder DNA maker作為分子量對(duì)照，于凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃乳(露)中DNA提取效率

核桃乳(露)中的DNA經(jīng)過高溫、高壓、滅菌等多道加工工藝，很難直接檢測(cè)出DNA提取是否成功。而通過檢測(cè)植物中葉綠體DNA片段，可以判定DNA是否符合PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)，從而避免檢測(cè)結(jié)果的假陰性。

本研究采用文獻(xiàn)報(bào)道的植物CP 03通用引物［5］，對(duì)各種品牌核桃乳(露)中DNA的提取質(zhì)量和提取效率進(jìn)行了PCR檢測(cè)。擴(kuò)增結(jié)果表明:除陰性對(duì)照外，被檢測(cè)的所有樣品均能擴(kuò)增出123bp片段大小的條帶，如圖1。說明所有樣品DNA均符合PCR擴(kuò)增的要求。

圖1 CP 03對(duì)不同核桃乳(露)樣品DNA擴(kuò)增的結(jié)果Fig.1 The PCR result of primer CP 03 in differentwalnutmilk materials

2.2 引物的特異性

以市面上一些常見堅(jiān)果、水果與大豆、花生、核桃的DNA為模板，分別用Arah1、Bd28 K引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果表明:Arah 1引物僅對(duì)花生DNA擴(kuò)增陽性，如圖2;Bd28 K引物僅對(duì)大豆DNA擴(kuò)增陽性，如圖3、圖4。

2.3 檢測(cè)方法的靈敏度

以花生DNA為標(biāo)準(zhǔn)添加品，按比例添加至核桃DNA中，獲得花生含量分別為10%、1%、0.1%、0.01%的系列稀釋品，Arah1引物PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖5。可見隨著花生成分濃度的降低，條帶逐漸減弱，Arah 1引物最低檢測(cè)限達(dá)到1%。大豆引物靈敏度檢測(cè)方法為，以大豆DNA為標(biāo)準(zhǔn)添加品，按上述方法進(jìn)行稀釋。可見Bd28 K引物最低檢測(cè)限達(dá)到0.1%，PCR結(jié)果如圖6。

2.4 核桃乳(露)中花生、大豆成分的檢測(cè)

在對(duì)所有核桃乳(露)樣品進(jìn)行了植物成分DNA檢測(cè)后(圖1)，分別進(jìn)行了核桃、花生、大豆成分的PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

圖2 Arah 1引物對(duì)不同植物DNA擴(kuò)增的結(jié)果Fig.2 The specificity test result of primer Arah 1 in different plants

圖3 Bd28 K引物對(duì)常見豆科植物DNA擴(kuò)增的結(jié)果Fig.3 The specificity test result of primer Bd28 K in common leguminosae

圖4 Bd28 K引物對(duì)常見非豆科植物DNA擴(kuò)增的結(jié)果Fig.4 The specificity test result of primer Bd28 K in non－leguminosae plants

結(jié)果表明:有四種樣品(5、6、7、21)未擴(kuò)增出核桃目的片段，如圖7。但用植物通用引物鑒定飲品DNA質(zhì)量時(shí)結(jié)果呈陽性，說明已提取出適合PCR擴(kuò)增的DNA，可能由于其核桃成分含量較低，低于檢測(cè)靈敏度以下，或根本不含核桃成分DNA所至。

圖5 Arah 1引物靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The sensitivity test of primer Arah 1

圖6 Bd28 K引物靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.6 The sensitivity test of primer Bd28 K

圖7 不同核桃乳(露)樣品中核桃成分檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Detection of walnut in differentwalnutmilk materials

在所有被檢測(cè)的22種核桃乳(露)中，有4種(樣品1、5、18、21)標(biāo)明含有花生成分。4種標(biāo)注含有花生成分的樣品均能擴(kuò)增出花生目的條帶，與產(chǎn)品中所標(biāo)識(shí)的成分完全一致。另有3種(樣品8、12、14)未標(biāo)明含花生成分的樣品也擴(kuò)增出花生目的條帶，說明也含有花生成分，為核桃與花生的混合飲品，與產(chǎn)品中所標(biāo)識(shí)的成分不符，表明摻假，如圖8。

在所有被檢測(cè)的22種核桃乳(露)中，有1種(樣品11)標(biāo)明含有大豆成分，但未擴(kuò)增出大豆目的條帶，可能不含大豆成分或含量較少。另2種(樣品1、22)未標(biāo)注含有大豆成分的樣品也擴(kuò)增出大豆目的條帶，說明含有大豆成分，為核桃與大豆的混合飲品，與產(chǎn)品中所標(biāo)識(shí)的成分不符，表明摻假，如圖9。

圖8 不同核桃乳(露)樣品中花生成分檢測(cè)結(jié)果Fig.8 Detection of peanut in differentwalnutmilk materials

圖9 不同核桃乳(露)樣品中大豆成分檢測(cè)結(jié)果Fig.9 Detection of soybean in differentwalnutmilk materials

3 結(jié)論與討論

核桃乳(露)在加工過程中經(jīng)過高溫加熱等工藝，可能導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)變性，使得蛋白水平的檢測(cè)困難且靈敏度不高。但PCR技術(shù)具有高效、靈敏、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，在加工食品尤其是深加工食品的有效成分鑒定方面具有重要作用［19］，它檢測(cè)的對(duì)象是比蛋白質(zhì)穩(wěn)定的DNA，在深加工食品中仍有DNA的存在。而且PCR方法較ELISA方法更為準(zhǔn)確，同時(shí)避免了對(duì)大量抗體的需求。因此，PCR檢測(cè)法更適用于深加工食品的檢測(cè)［14，20］。

在所有被檢測(cè)的22種核桃乳(露)中有3種未標(biāo)明含有花生的樣品檢測(cè)出花生成分、2種未標(biāo)明含有大豆的樣品檢測(cè)出大豆成分，與產(chǎn)品標(biāo)識(shí)不符。有2種品牌核桃乳(露)未檢測(cè)到原材料核桃成分，可見被其他植物成分取代。這些摻假行為損害了消費(fèi)者的利益，擾亂了飲品市場(chǎng)，因此，建立快速、靈敏的核桃乳(露)中摻入花生、大豆成分的檢測(cè)方法，不但能可靠鑒別核桃乳(露)中的花生、大豆成分，同時(shí)也可將此方法作為核桃乳(露)飲品中其他植物源成分檢測(cè)的依據(jù)。本研究通過對(duì)植物葉綠體基因的檢測(cè)來判斷是否提取出DNA，從而可有效防止假陰性結(jié)果的發(fā)生，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。研究結(jié)果表明該方法提取的DNA效率高、純度好，Arah 1和Bd28 K引物靈敏度分別達(dá)1%和0.1%，適于PCR擴(kuò)增。可作為核桃乳(露)中摻入花生、大豆成分檢測(cè)的有效方法，也可為其他與食品鑒偽相關(guān)的方法研究提供可靠參考依據(jù)。

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