半夏瀉心湯含藥血清對人胃癌腹膜轉移細胞增殖的影響*

李東峰，趙聞平，劉喜平，明海霞，孫少伯，張 煒

1天水市中醫醫院急診科，甘肅 天水 741000；2甘肅省軍區干休所衛生所；3甘肅中醫學院教育部“敦煌醫學與轉化”重點實驗室；4蘭州大學第一醫院外科

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤。胃癌細胞易脫落入腹腔，形成腹膜播散種植，約25%的胃癌患者在術前或術中有腹膜轉移發生。進展期胃癌術后有40%～60%的患者發生腹膜轉移，最終導致頑固性癌性腹水、腸道梗阻、惡液質，成為患者死亡或影響預后的重要因素之一［1］。如何有效預防、及時阻斷腹膜轉移成為胃癌治療領域的研究熱點之一。本研究就半夏瀉心湯含藥血清對人胃癌腹膜轉移細胞GC9811-P的增殖進行了初步觀察，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 動物 家兔，體質量2.0～2.5 kg，共4只，由蘭州生物制品研究所實驗動物中心提供，實驗設施使用證號：SYXK(甘)2004-0006，實驗動物質量合格證號：SCXK(甘)2004-006。

1.2 藥物及試劑 半夏瀉心湯藥材由甘肅中醫學院附屬醫院提供，經甘肅中醫學院中藥鑒定教研室鑒定符合藥典規定；培養液：含10%胎牛血清RPMI1640培養液；消化液：0.25%胰蛋白酶消化液；5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracia、簡 5-FU)：用時采用RPMI-1640培養液稀釋至所需濃度；RPMI-1640：GIBC Laboratories，USA生產；人胃癌腹膜高轉移潛能細胞株GC9811-P由本實驗室引進。

1.3 方法

1.3.1 半夏瀉心湯實驗藥物的制備 按原處方比例稱取半夏12 g，干姜9 g，黃芩9 g，黃連2 g，人參9 g，大棗4 g，甘草9 g藥材飲片，置多能提取器中，加水煎煮2次，第1次加8倍量水，煎煮1.5小時，第2次加6倍量水，煎煮1.0小時，合并2次煎液，離心濾過，濾液減壓濃縮至含生藥2 g/mL的浸膏，即得。

1.3.2 半夏瀉心湯含藥血清的制備 依照參考文獻［2］方法，實驗前4只家兔禁食12小時，灌胃給藥，半夏瀉心湯藥物組2只家兔灌服半夏瀉心湯，空白組2只家兔給予相同體積的生理鹽水。給藥劑量：每次26mL/kg，相當于60 kg成人日服用量的10倍；給藥方式：連續灌胃3次,第1、2次間隔20小時，第2、3次間隔4小時；采血時相：第3次給藥后2小時無菌條件下心臟采血，靜置4小時，3 000 r/min離心20分鐘，分離血清(藥物血清，DS)，同種條件下藥物血清混勻，56℃，30分鐘水浴滅活，-20℃冰箱保存備用。經培養沒有微生物生長。

1.3.3 MTT法測定半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P細胞的敏感性 將人胃癌腹膜高轉移潛能細胞株GC9811-P用含有青、鏈霉素各100 U/mL、15%小牛血清的RPMI-1640培養液培養。采用MTT法即選擇指數生長期的GC9811-P細胞，調整細胞懸液濃度為1×108/L，接種于96孔板，每孔接種100μL，另加培養基 100μL；37℃，5mL/LCO2條件下培養24小時，更換無血清培養基繼續培養24小時，吸棄上清液。取對數生長期的GC9811-P細胞，細胞存活率達95%以上，先用0.25%胰蛋白酶消化培養細胞，再用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液配成單個細胞懸液，以每孔1×104個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積200μL。分組：含藥血清組(在細胞液中加入最終濃度分別為5%、10%的半夏瀉心湯含藥血清)，空白血清組(加正常家兔血清對照組)。將培養板放入CO2培養箱，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下分別培養24、48、72小時。每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，37℃繼續孵育4小時后，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加入150μLDMSO。在490 nm波長下，用酶聯免疫檢測儀測定各孔吸光度A值，按下列公式求出細胞存活率，細胞存活率=含藥血清組吸光度A/空白血清組吸光度A×100%。每個樣品計數4次，根據3次實驗結果求平均值和標準差(χ±s，n=3)。

1.3.4 臺盼蘭染色法測定半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P細胞生長的影響 取一瓶對數生長期的細胞，細胞存活率達95%以上。用含有15%小牛血清的RPMI-1640培養液將細胞數調節為2～3×105個/mL，接種于96孔塑料培養板中。分組同“1.3.3”項。置 37℃、5%CO2培養箱培養 24、48、72小時。取出后，加入4%臺盼蘭染液，顯微鏡下計數存活細胞數。顯蘭色的為死細胞，未顯色的為活細胞，按下列公式：

細胞生長抑制率(%)=［(空白血清組活細胞數-含藥血清組活細胞數)/空白血清組活細胞數］×100%

每個樣品計數3次，根據3次實驗結果求平均值和標準差(χ±s，n=3)。

2 結果

2.1 半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P細胞敏感性的影響 與空白血清組比較，半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P細胞的細胞存活率有一定的影響，吸光度A值有明顯差異(P＜0.05)；細胞存活率在48小時最為明顯，但濃度之間的差異并不顯著，見圖 1、表 1。

圖1 不同濃度含藥血清對細胞存活率的影響

表1 半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P細胞敏感性的影響(χ±s)

2.2 半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P細胞生長的影響 與空白血清組比較，不同濃度半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P細胞生長都有一定的抑制作用，在48小時最為明顯，且與含藥血清濃度存在正相關，即隨濃度上升表現出顯著的劑量-效應關系(P＜0.05)，見表 2、圖 2。

表2 半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P細胞生長的影響(χ±s)

圖2 不同濃度含藥血清對細胞抑制率的影響

3 討論

祖國醫學雖沒有與胃癌腹膜轉移相對應的病名，但有與胃癌腹膜轉移臨床特征相類似的描述，如“胃脘痛”“噎嗝”“痞滿”“呃逆”“積聚”“反胃”等。胃癌晚期或術后形成腹膜轉移大多具有本虛標實的特點。本虛主要以脾胃虛弱為主，標實主要以痰濁和癌毒阻滯為主，痰滯成積既是胃癌的病理表現，又是胃癌形成和進一步發展的病因，“痰之為物，隨氣升降，無處不到”。痰滯與胃癌易于浸潤轉移的特點相類似。手術以后，正氣受戕，脾失健運，水濕運化失司，易促進痰濁的再次生成，恰好又為胃癌的復發及轉移創造了物質條件。而癌毒流竄走注是胃癌腹膜轉移的根本原因，癌毒停積它處，繼續阻隔經絡氣血，釀生痰瘀，癌毒與痰瘀搏結，則又形成腫塊［3］。以上諸多因素，均可影響氣機的正常升降。多數學者認為本病臨床辨證多為復合證型，其特點以虛實夾雜、寒熱互結為主，病機關鍵在于升降失調，辛開苦降是其關鍵治法。

半夏瀉心湯出自《傷寒論》，主治寒熱錯雜之痞證，為辛開苦降法的代表方劑。近年來本方在胃癌的防治中已取得較好的臨床療效［4-6］。本方突出辛開苦降，升降同調，以復中焦之升降。同時兼益氣健脾，調理脾胃以扶正，具有寒熱并用，溫而不燥，寒而不遏之特點。配伍嚴謹，藥少力專，與胃癌的中醫主要病機十分吻合。課題前期研究表明半夏瀉心湯含藥血清可抑制人胃癌細胞增殖、誘導人胃癌細胞凋亡，并從抗氧化、下調bcl-2及p53等胃癌相關表達基因方面探討了半夏瀉心湯防治胃癌的作用機理［7-8］。

GC9811-P為胃癌細胞經腹腔連續傳代，隨著腹膜轉移率增高的演進，得到一株腹膜高轉移細胞株，腹膜轉移形成率為100%［9］。本研究表明，半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P較為敏感，對其增殖有明顯的抑制作用，且有顯著的劑量-效應關系。提示辛開苦降法可能是中醫藥防治胃癌腹膜轉移的主要治法之一，并為其提供了重要線索，至于本方在體內對胃癌腹膜轉移的抑制作用及其機理，尚需要進一步研究。

［1］ YonemuraY，BanouE，KawamuraT，etal.Quantitative prognosticindicatorsofperitonealdissemination ofgastriccancer［J］.EurJSurgOncol，2006，32(6)：602-606.

［2］ 李振光，王凈凈.關于中藥血清藥理學方法的思考［J］.中國中醫藥信息雜志，2002，9(2)：5-6.

［3］ 程海波，吳勉華.周仲瑛教授“癌毒”學術思想探析［J］.中華中醫藥雜志，2010，25(6)：866-869.

［4］ 楊瑞合.半夏瀉心湯調治消化道腫瘤三則［J］.陜西中醫，1988，9(4)：171-172.

［5］ 祝遠之，賈崇花.半夏瀉心湯治療脾胃病新用［J］.河北中醫，1999，21(5)：239.

［6］ 豐素娟.半夏瀉心湯防治胃癌前病變的實驗與臨床研究［J］.中成藥，2000，22(8)：576-577.

［7］ 李沛清，劉喜平，席時燕.半夏瀉心方及其配伍藥組含藥血清對人胃癌BGC823細胞生長抑制作用及p53表達的影響［J］.中藥藥理與臨床，2005，21(5)：5-7.

［8］ 劉喜平，李沛清，席時燕，等.半夏瀉心方配伍與誘導BGC-823細胞凋亡關系的血清藥理學研究［J］.中醫雜志，2006，47(2)：134-137.

［9］ 白飛虎，李來生，郭新寧，等.胃癌腹膜高轉移潛能細胞系的建立及其生物學特性［J］.腫瘤防治研究，2006，33(3)：145-147.