內源性下行抑制易化系統與5-羥色胺對脊髓傷害感受性信息的調制

楊 宇 陳 夢 張美琴 張宇平 呂思航

1.沈陽醫學院生理學教研室,遼寧沈陽 110034；2.沈陽醫學院臨床醫學系2011 級學生，遼寧沈陽 110034

5-羥色胺（5-HT)是下行抑制系統參與機體鎮痛作用的主要神經性活性物質，下行抑制系統是外周損害性信息向中樞神經系統傳導的重要結構，脊髓背角層是下行抑制系統重要組成元件[1]。該系統主要由腦干中縫核簇、導水管周圍灰質及相鄰網狀結構組成。5-HT 可密集分布在背角膠層內，且5-HT 可通過與不同受體結合作用于不同脊角淺層傳遞傷信息性神經元傷害中從而起到抑制神經痛覺傳導的作用[2]。為此本文通過建立脊髓神經損失大鼠模型探討內源性下抑制易化系統與5-羥色胺（5-HT)對脊髓傷害感受性信息的作用機制及針刺對疼痛傳導的影響，旨在為臨床神經疼痛性疾病的防治提供實驗依據。

1 材料及方法

1.1 動物及分組

2013年1月—2013年12月選取40只Wistar 成年健康雄性大鼠（由沈陽醫學院實驗動物中心提供），體重為（250±10）g，晝夜節律適應性飼養1周，室溫控制在（25±1）℃。隨機將大鼠分為分為正常對照組、假性手術組、模型組及針刺組，每組各10只Wistar大鼠。

1.2 模型的建立

通過分支結扎將腓總神經和左側坐骨神經干脛神經切斷，將坐骨神經剝離，保留腓總神經建立大鼠脊髓損傷模型，術前常規禁食6～8h，術前30 min 分別肌內注射0.5mg 阿托品（鄭州羚銳制藥股份有限公司，規格1mL：0.5mg,產品批號0907201,），0.01g 魯米那鈉（上海新亞藥業有限公司生產,批號040921），對照組只做麻醉處理，麻醉后靜置60 min。假手術組：麻醉后開膛后在坐骨神經下穿線，不損傷腓總神經和左側坐骨神經干脛神經。模型組：麻醉后分支結扎將腓總神經和左側坐骨神經干脛神經切斷，將坐骨神經剝離，保留腓總神經。針刺組：針刺內關穴5 d 后實施麻醉，操作與模型組相同。

1.3 針刺方法

根據《實驗針灸學》[3]中大鼠穴位針灸方法從而擬對比人體取內關穴（即位于大鼠橈、尺骨縫中，前臂下1/6 折點位置，采用醫用30 號毫針刺激內關穴位1～2 mm，并留針1 min，共30 min，1次/d，持續針刺5 d。

1.4 Western bloting 檢測

術后1、2、3、7、14、28d 每組分別抽取健康狀況良好的5只大鼠抽取C5～T1 階段的脊髓背角和背神經中靜脈血液5 mL，并在4℃環境中以1200r/min 的速度離心處理15 min，留取上清液。采用由美國Pierce 公司提供BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取40ug 總蛋白進行SDS-PAGE 電泳、轉膜及封閉實驗，并加入由博士德公司提供的5-HT 抗體進行孵育震蕩過夜。次日將膜取出經TBS 漂洗后加入美國Gell signaling 公司提供的羊抗兔二抗于室溫下孵育1h，采用ECL 發光法進行漂洗染色。同時采用Image 1 36b 軟件測定蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值。

1.5 統計學分析

應用SPSS 17.0 軟件對結果進行分析，計量資料采用均數標準差（）表示，組間均值的比較采用t 檢驗，進一步的兩兩比較采用LSD﹣t 法，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

模型組大鼠脊髓背角和背神經中5-HT 蛋白于術后1、2、3、7、14、28d 顯著高于模型組假性手術組（t=3.589,3.228,3.784,3.227,3.142 和t=3.992,4.025,3.726,3.821,3.116），而針刺組大鼠脊髓背角和背神經中5-HT 蛋白顯著下降（t=4.263,4.022,4.079,3.256,3.215 和t=4.021,4.258,3.778,3.982,3.441），差異有統計學意義（P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠脊髓背角和背神經中5-HT 蛋白表達情況

3 討論

5-HT 是機體內源性活性物質，5-HT 不僅能參與機體免疫及炎癥反應，同時還能參與機體中縱多病理疾病的生理過程，當機體出現體內免疫反應及受損時可導致機體5-HT 大量釋放，并作用于效應細胞受體中，并引起炎癥反應[4]。此外，當機體生理狀態出現改變時，機體中5-HT 也可大量釋放，并直接或間接參與機體相關調控，從而使得機體出現生理病理性改變。相關研究指出[5]，機體內源下行系統調控完整性與5-HT 參與機體信號傳導具有重要的作用。劉希江[6]等認為5-HT 可通過5-HT 受體作用于阻抗性傷害性沖動傳導，并降低疼痛敏感性，從而減少疼痛對機體的傷害。本研究通過建立脊髓神經損失大鼠模型探討內源性下抑制易化系統與5-羥色胺（5-HT)對脊髓傷害感受性信息的作用機制，結果顯示模型組大鼠脊髓背角和背神經中5-HT 蛋白（286.3±22.7）%、（178.9±14.8）%于術后2 d 顯著高于模型組假性手術組（64.3±14.2）%、（42.3±4.3）%，而針刺組大鼠脊髓背角和背神經中5-HT 蛋白（142.3±21.3）%、（102.3±11.3）%顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05)，從而表明脊髓背角和背神經中5-HT 蛋白缺失可能與脊髓神經損傷疼痛有關，通過針刺脊髓能促使脊髓背角和背神經中5-HT 蛋白表達，從而抑制脊髓傷害后疼痛刺激的傳導。

[1]劉希江,曹菲,卜慧蓮，等.脛骨癌痛大鼠脊髓背角5-羥色胺水平的變化[J].中華麻醉學雜志,2011,31(6)：695-698.

[2]甄龍,徐改玲,甄英偉，等.神經病理性疼痛患者血清BDNF,5-HT 水平[J].神經疾病與精神衛生,2013,13(2)：154-157.

[3]王巍,邵曉丹,邵寶盛，等.“三才刺”對腎絞痛患者血漿、尿液中P 物質、5-羥色胺水平的影響[J].針刺研究,2013,38(2)：152-157.

[4]楊娜娜,王熠釗,周寧，等.5-HT2A 和5-HT2C 受體與脊髓運動功能以及疼痛關系的研究進展[J].中華物理醫學與康復雜志,2013,35(9)：740-743.

[5]門凌,張洪欽.治偏痛膠囊治療偏頭痛的療效及對血漿5-羥色胺的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(13)：336-339.

[6]劉希江,曹菲,卜慧蓮，等.紫杉醇誘導神經病理性疼痛大鼠脊髓背角5-羥色胺含量變化[J].臨床麻醉學雜志,2012,28(3)：262-264.