人臍帶間充質干細胞的高效分離及對小鼠免疫功能的影響

秦力維，張寧坤，郭建巍，彭秀軍，王桂琴，曹利群，田春雨，崔 蓓，王 靜，高 原

·生物樣本庫·

人臍帶間充質干細胞的高效分離及對小鼠免疫功能的影響

秦力維，張寧坤，郭建巍，彭秀軍，王桂琴，曹利群，田春雨，崔 蓓，王 靜，高 原

目的建立一種從健康人臍帶中分離間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的簡單、經濟、高效方法，并探討其對小鼠免疫細胞的影響。方法取經剖宮產獲得的健康人臍帶血管與外膜之間的膠狀物并剪切成小于1mm3的小塊，用組織塊貼壁法直接培養MSCs，并用獲得的MSCs注射于健康C57 BL/6小鼠皮下。結果獲得的MSCs高表達CD105、CD73、CD44和CD90，不表達CD34、CD45和人類白細胞抗原-DR，符合干細胞的各種生物學特性。結論用簡便、經濟的方法獲得了健康人臍帶間充質干細胞，注射C57 BL/6小鼠體內后，小鼠的血細胞及T細胞亞型未改變，自身免疫系統穩定，為進一步的研究奠定了實驗基礎。

臍帶；間充質干細胞；直接貼壁法；異種注射

[注 明]秦力維，張寧坤:并列第一作者DMEM)培養基(美國，HyClone公司)、青霉素和鏈霉素(美國，HyClone公司)、胎牛血清(美國，Gibco公司)；生物安全柜(美國，Thermo公司)；CO2培養箱(美國，Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(日本，Olympus公司)；普通離心機(杭州奧盛儀器有限公司)；恒溫水浴箱(上海森信實驗儀器有限公司)；一次性無菌培養瓶、離心管、移液管、過濾器(美國，Gibco公司)。

FACSCaliburTM流式細胞儀(美國，Becton Dickinson公司)，功率15 W，激光光源采用氬離子氣體激光器，波長488 nm，進行藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、甲藻葉綠素蛋白(peridinin chlorophyll protein，PerCP)等檢測；另配小功率半導體激光器，波長為635 nm，別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)檢測。全自動血球分析儀(日本，Sysmex公司)。18～20 g雌性C57 BL/6 30只wide type(WT)小鼠購自海軍總醫院實驗動物中心[SCXK-(京)-2011-0006]。1.2 試劑配制 DMEM完全培養基:90 mL DMEM培養基＋20 mL特級胎牛血清(100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素)。

1.3 方法

1.3.1 臍帶間充質干細胞分離 無菌取剖宮產新鮮臍帶，以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗去臍帶殘留血液，剪成3～4 cm的小段，每一段沿靜脈腔剪開，平鋪后剔除臍帶動、靜脈；取血管之間血管與外膜之間的膠狀物，并剪切成小于1 mm3小塊，以PBS沖洗后，把組織塊放置含15%胎牛血清的DMEM培養基，在37℃5%CO2培養箱中培養。

1.3.2 臍帶間充質干細胞培養 倒置相差顯微鏡下觀察組織塊，24 h后半量換液，待組織塊周圍均有細胞出現時，移出組織塊；當細胞擴增占80%～90%細胞瓶底面積時，用0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸液消化后傳代，用0.01 mol/L PBS調整細胞為5×105/mL，0.01 mol/L PBS洗滌2次后，加入PBS 1 mL重懸細胞，取1×106個細胞待用。用第3代細胞進行實驗。

1.3.3 臍帶間充質干細胞鑒定 取1×106個細胞，加100μL的細胞染色緩沖液，根據抗體說明書加入相應體積的抗體[小鼠抗人PE、APC或FITC標志的單抗CD105、CD73、CD44、CD90、CD34、CD45和人類白細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)-DR]，室溫孵育30 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500μL PBS上機檢測。

1.3.4 分組 用無菌PBS調整臍帶間充質干細胞至1×106/mL，隨機數字法將30只雌性小鼠分為實驗組及對照組，每組15只。實驗組于每只小鼠腹股溝皮下多點注射MSCs細胞液，每只注射0.5 mL，連續注射3 d；對照組腹股溝皮下多點注射PBS 0.5mL。7 d后尾靜脈取血檢測小鼠血常規，處死后流式細胞儀檢測外周血細胞、脾細胞T細胞亞群變化。

1.4 統計學處理 應用SPSS 17.0軟件，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 培養結果 培養至第7天時，倒置相差顯微鏡下觀察到臍帶組織塊周圍有成纖維樣細胞爬出，移出組織塊后，可見大量貼壁細胞。細胞形態不規則，邊緣較鈍，細胞間雜質較多。培養第10天，細胞轉變為長梭形，細胞間雜質消失，細胞邊緣光滑，呈成纖維細胞樣形態。傳代至第3代時，細胞內外不見明顯顆粒，細胞表面光滑、狀態良好(圖1)，用于后續實驗。

圖1 倒置相差顯微鏡下的臍帶間充質干細胞(×200)

2.2 臍帶間充質干細胞免疫表型的鑒定 經流式細胞儀檢測，分離培養的臍帶間充質干細胞表達骨髓間質干細胞的表面標志CD105(90.0%)和CD44 (99%)、CD73(85.1%)和CD90(99.5%)，很少表達造血干細胞的表面標志CD34(0.32%)、CD45(0.27%)和HLA-DR(1.03%)。見圖2～6。

圖2 CD105和CD44分子在臍帶間充質干細胞表面的表達

圖3 CD73和CD90分子在臍帶間充質干細胞表面的表達

圖4 CD34分子在臍帶間充質干細胞表面的表達

圖5 CD45分子在臍帶間充質干細胞表面的表達

圖6 HLA-DR分子在臍帶間充質干細胞表面的表達

2.3 小鼠外周血細胞、脾細胞T細胞亞群的變化

小鼠腹股溝皮下多點注射臍帶間充質干細胞7 d后，尾靜脈取血進行血常規檢測；結果顯示，與對照組相比，小鼠白細胞計數、紅細胞計數、血小板計數和血紅蛋白水平差異均無統計學意義(P＞0.05，表1)；實驗組與對照組相比，脾臟CD3＋CD4＋細胞、CD3＋CD8＋細胞數量、CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋比值差異均無統計學意義(P＞0.05，表2)。

表1 注射臍帶間充質干細胞后小鼠外周血細胞的變化

表2 注射臍帶間充質干細胞后小鼠脾細胞T細胞亞群的變化

3 討論

間充質干細胞來源于中胚層的間充質，分布廣泛，形態與成纖維細胞相似，是一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的成體干細胞，已在組織工程領域展現出良好的應用前景。臍帶間充質干細胞在特性上類似于骨髓間充質干細胞，但在增殖及分化潛能方面優于骨髓間充質干細胞，并且易于獲得、取材方便，排除了倫理道德方面限制，容易工業化制備，是組織工程和再生醫學理想的種子細胞[1]。

臍帶間充質干細胞培養一般采用酶消化法、組織塊貼壁法和兩者聯合的方法[2-3]。我們在長期研究中發現，用酶消化法分離臍帶干細胞時使用大量的Ⅱ型膠原酶，這種方法耗時長達20 h。由于Ⅱ型膠原酶的大量使用，使組織消化過程不易控制，常導致細胞活性降低，表面受體降解甚至功能改變。實驗中使用的膠原酶均為進口產品，價格不菲，使實驗成本增加。

本研究中，將要培養的臍帶組織塊剪切成小于1 mm3大小的小塊，經PBS充分洗滌后，使用組織塊直接貼壁培養，在處理及培養過程中不使用0.2%Ⅱ型膠原酶，同時在培養液中加大胎牛血清至15%，加速了組織塊的貼壁。這種方法使組織塊中的干細胞能在48 h左右爬出并貼壁，增加了細胞生長的速度。換液過程中充分利用干細胞生長過程中分泌的各種細胞及組織生長因子，進行半量換液，始終使細胞處于有細胞和組織生長因子的狀態，使細胞生長狀態良好，增殖加快。實驗結果證實本方法培養的臍帶間充質干細胞鏡下呈長梭形或多角形，平行生長或漩渦狀生長，高表達CD105、CD73、CD44和CD99，不表達CD34、CD45和HLA-DR，符合干細胞的各種生物學特性[4]。

近年來，臍帶間充質干細胞在組織損傷的治療中得到了很多應用。有學者將人臍帶間充質干細胞移植給視網膜疾病的嚙齒目動物，可挽救其光感受器，效果優于骨髓間充質干細胞或胎盤干細胞移植[5]；可顯著降低心搏驟停復蘇所致的腦缺血大鼠神經元的喪失[6]；可改善脫水誘導的帕金森病大鼠動作的缺陷[7]。由于免疫原性低，同種異體移植無免疫排斥反應或反應較弱，已有異種移植對自身免疫性疾病的防治[8]及治療糖尿病[9]、肝損傷[10]方面的研究報道。

在眼科疾病的研究中，MSCs有利于視網膜色素變性和視網膜光損傷的治療[11-12]；它具有神經保護作用，可減輕或延緩視網膜組織損傷，在視網膜缺血再灌注損傷和青光眼的治療中具有廣闊的應用前景[13-14]；MSCs還具有免疫調節作用，它可抑制脈絡膜新生血管生長并促進其消退[12]。在后續研究中，我們將用獲得的人臍帶間充質干細胞治療實驗動物的各種眼科疾病的研究。

相對于實驗動物來說，人MSCs是異種來源的細胞，對于來源于不同人體、不同培養方式得到的人臍帶間充質干細胞，重復多次輸注，受體動物是否安全、是否產生免疫原性?帶著這個問題，本研究將獲得的人臍帶間充質干細胞注入健康小鼠，7 d后對其血細胞及脾細胞T細胞亞群進行了分析測定，結果顯示注入臍帶間充質干細胞后小鼠的血細胞及免疫細胞表型均沒有明顯的改變，進一步證實了有關研究的結果[15]，可以用于后續的實驗研究。

[1]Baksh D，Yao R，Tuan RS.Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bonemarrow[J].Stem Cells，2007，25(6):1384-1392.

[2]Troyer DL，Weiss ML.Wharton′s jelly-derived cells are a primitive stromal cell population[J].Stem Cells，2008，26 (3):591-599.

[3]Kestendjieva S，Kyurkchiev D，Tsvetkova G，et al.Characterization ofmesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord[J].Cell Biol Int，2008，32(7):724-732.

[4]DominiciM，Le Blanc K，Mueller I，et al.Minimal criteria for definingmultipotentmesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement [J].Cytotherapy，2006，8(4):315-317.

[5]Lund RD，Wang S，Lu B，et al.Cells isolated from umbilical cord tissue rescue photoreceptors and visual functions in a rodentmodel of retinal disease[J].Stem Cells，2007，25(3):602-611.

[6]Jomura S，Uy M，Mitchell K，et al.Potential treatment of cerebral global ischemia with Oct-4＋umbilical cordmatrix cells[J].Stem Cells，2007，25(1):98-106.

[7]Weiss ML，Medicetty S，Bledsoe AR，et al.Human umbilical cordmatrix stem cells:preliminary characterization and effect of transplantation in a rodentmodel of Parkinson′s disease[J].Stem Cells，2006，24(3):781-792.

[8]Hao H，Chen G，Liu J，et al.Culturing on Wharton′s jelly extract delaysmesenchymal stem cell senescence through p53 and p16INK4a/pRb pathways[J].PLoSOne，2013，8 (3):e58314.

[9]Fu YS，Cheng YC，Lin MY，etal.Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Wharton′s jelly to dopaminergic neurons in vitro:potential therapeutic application for Parkinsonism[J].Stem Cells，2006，24(1): 115-124.

[10]Yu J，Cao H，Yang J，etal.In vivo hepatic differentiation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood after transplantation into mice with liver injury[J].Biochem Biophys Res Commun，2012，422(4):539-545.

[11]Wang S，Lu B，Girman S，et al.Non-invasive stem cell therapy in a ratmodel for retinal degeneration and vascular pathology[J].PLoSOne，2010，5(2):e9200.

[12]Hou HY，Liang HL，Wang YS，et al.A therapeutic strategy for choroidal neovascularization based on recruitment of mesenchymal stem cells to the sites of lesions[J].Mol Ther，2010，18(10):1837-1845.

[13]LiN，Li XR，Yuan JQ.Effects of bone-marrow mesenchymal stem cells transplanted into vitreous cavity of rat injured by ischemia/reperfusion[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2009，247(4):503-514.

[14]Johnson TV，Bull ND，Hunt DP，et al.Neuroprotective effects of intravitreal mesenchymal stem cell transplantation in experimental glaucoma[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(4):2051-2059.

[15]何君，李洋，陳威，等.人臍帶間充質干細胞靜脈輸注小鼠的安全性[J].中國比較醫學雜志，2013，23(9):36-41.

Effective isolation of human umbilical cord mesenchymal stemcells and immunity changes after injection in mice

QIN Liwei1，ZHANG Ningkun2，GUO Jianwei3，PENG Xiujun1，WANG Guiqin1，CAO Liqun1，TIAN Chunyu1，CUIBei1，WANG Jing1，GAO Yuan1
(1.Department of Ophthalmology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2.Heart Center，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；3.Department of Laboratory，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

ObjectiveTo explore an effective，convenient and economicalmethod for extraction and cultivation human umbilical cord mesenchymal stem cells(MSCs)and discussion changes of peripheral blood cells and T lymphocyte subgroups in C57 BL/6 mice after MSCs infection.MethodsUnder sterile conditions，umbilical artery and vein were excluded from cesarean section fetal umbilical cord，cut umbilical cord into shiver smaller than 1 mm3and cultured in vitro until getting adherent cells.5×106MSCs were injected subcutaneously in C57 BL/6 mice for 3 days.ResultsMSCs were effectively isolated from human umbilical cord with high expression CD105，CD73，CD44 and CD90moleculars，but less expression for CD34，CD45 and human leucocyte antigen-DR moleculars.ConclusionAn effective，convenient and economical method to isolate and culture MSCs in vitro was successfully established.No changeswere detected in peripheral blood cells and T lymphocyte subgroups of C57 BL/6 mice after MSCs infection.

Umbilical cord；Mesenchymal stem cells(MSCs)；Direct adherent cells；Xerogeneic injection

R329

A

2095-3097(2014)06-0333-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2014.06.004

1 材料與方法

海軍總醫院創新培育基金資助(CXPY201312)

100048北京，海軍總醫院眼科(秦力維，彭秀軍，王桂琴，曹利群，田春雨，崔 蓓，王 靜，高 原)，心臟中心(張寧坤)，檢驗科(郭建巍)

高 原，E-mail:gaoyuan999＠sina.con

2014-05-27 本文編輯:馮 博)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新及多向分化潛能的干細胞，廣泛存在于成體及胎兒的各種組織中，在組織再生和修復中具有重要作用。由于來源于成體組織MSCs數量有限，限制了其臨床應用。近年來的研究發現，來源于臍帶的MSCs具有更強的增殖效力和自我更新能力，是再生醫學理想種子細胞[1]。本研究擬建立一種從健康人胎盤臍帶中分離MSCs的簡單、經濟、高效方法，并探討其對小鼠免疫細胞的影響，為MSCs的廣泛使用奠定實驗基礎。

1.1 材料與儀器 新生兒臍帶取自海軍總醫院婦產科(37～40周胎齡剖宮產健康胎兒)。達爾伯克改良伊格爾(Dulbecco′smodification of Eagle′smedium，