大鼠視神經少突膠質細胞培養方法的改良

王曉虹，王蘇平，車菊華，王 虹，汪 濤，朱艷玲

·基礎研究·

大鼠視神經少突膠質細胞培養方法的改良

王曉虹，王蘇平，車菊華，王 虹，汪 濤，朱艷玲

目的改良既往新生大鼠視神經組織塊培養法體外培養少突膠質細胞。方法新生2 d SD大鼠，無菌條件下取雙側視神經，置于預先涂有多聚賴胺酸的培養皿中(直徑3.5 cm)，加入基礎培養液約400 μL；培養第4天時，更換為含0.5%胎牛血清化學限定培養液約400μL；約第10天時，更換為無胎牛血清化學限定培養液約600μL；第11天行髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)細胞免疫化學鑒定，計算陽性細胞百分率。重復培養3次，方差分析方法的穩定性。結果視神經培養至第11天，每皿細胞數可達(6～8)×105個，90%以上為MBP陽性細胞；3次培養細胞的MBP免疫細胞化學染色陽性細胞百分率差異無統計學意義(P＞0.05)。結論本實驗方法所得成熟少突膠質細胞純度高，數量足夠一般細胞生物學實驗使用，且方法簡便、穩定。

視神經；少突膠質細胞；細胞培養

少突膠質細胞是中樞神經系統的髓鞘形成細胞，其突起包繞神經元軸突構成多層膜性結構，協助神經電信號的跳躍式高效傳遞，維持和保護神經元的正常功能。開展少突膠質細胞的體外培養，有利于研究少突膠質細胞形成髓鞘的機制、損傷后修復，為臨床治療遺傳性脫髓鞘、多發性硬化的少突膠質細胞相關疾病奠定基礎。由于腦組織中含有多種神經細胞，同時成熟的少突膠質細胞不再具有分裂增殖能力，為分裂終期細胞[1]，因此如何獲取純化、足量的少突膠質細胞是深入研究的前提。少突膠質細胞的培養方法有震蕩法[2]、免疫“淘選”法[3]和神經干細胞定向分化培養[4]等，但前者獲取的細胞數量少，而后兩者要求的條件較高、花費昂貴、操作過程復雜。近年來多采用振蕩法結合差速貼壁法，但培養周期較長[5]。因此，獲得一種簡單、經濟、高效的少突膠質細胞培養方法具有重要意義。

視神經是具有中樞神經特征的周圍神經，不含神經元胞體和室管膜細胞[6]，主要有Ⅰ、Ⅱ型星形膠質細胞和少突膠質細胞3種大膠質細胞，是研究膠質細胞在體外發育的極好材料。本實驗在既往新生大鼠視神經組織塊培養法體外培養少突膠質細胞基礎上，經過探索，對其加以改良，方法簡單，經濟，可獲得實驗用足量純化的少突膠質細胞。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清(foetal bovine serum，FBS)、亞硒酸鈉、谷氨酰胺、甲狀腺素、轉鐵蛋白(美國，Sigma公司)；達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)/F12培養基(美國，HyClone公司)；髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)抗體、鏈霉親和素-生物素復合物(strept avidin-biotin complex，SABC)試劑盒(武漢博士德生物制劑公司)。CO2培養箱(日本，SANYO Electric CO.Ltd)、倒置相差顯微鏡(德國，LEICA公司)。新生2 d SD大鼠[大連醫科大學實驗動物中心，SCXK-(遼)-2008-0002]。培養液均以DMEM/F12培養基配制，加入100 U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素。培養用液配方[7]見表1。

表1 培養用液配方

1.2 方法

1.2.1 視神經少突膠質細胞培養 新生2 d SD大鼠，75%乙醇浸泡2 min后，立即移進超凈臺，無菌條件下取雙側視神經，置于無菌培養皿中，剔除血管，預冷(4℃)的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗3遍。常溫下0.125%胰酶消化3～5 min，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液終止消化，將組織塊移入預先涂有多聚賴胺酸的培養皿中(直徑3.5 cm)，每皿3對神經，加入基礎培養液(使組織塊接觸到培養液，又不懸浮于培養液，約400μL)，37℃、5%CO2培養箱中培養；第4天時，更換為化學限定培養液A(約400 μL)；每周更換培養液2次。約第10天時，更換為化學限定培養液B(約600μL)，此時細胞生長成熟，1 d后進行免疫細胞化學染色。

1.2.2 少突膠質細胞免疫細胞化學鑒定及計數

細胞生長至11 d時，原位進行細胞免疫化學鑒定，按照SABC試劑說明進行。一抗為1∶100 MBP抗體，蘇木素和伊紅復染，乙醇脫水，50%無水乙醇及50%甘油混合液封閉培養皿，4℃保存。每皿計數500個細胞中MBP陽性細胞個數，計算MBP陽性細胞百分率。實驗重復3次，每次設3個平行培養皿。1.3 統計學處理 應用SPSS 13.0軟件，每次MBP陽性細胞百分率以均數±標準差(±s)表示，3次間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 少突膠質細胞培養形態學觀察 視神經組織塊24 h開始貼壁，48～72 h可見組織邊緣游出少量細胞，主要為梭形。9～10 d，細胞基本全部從組織塊中游離出來，平鋪于皿底，組織塊呈透明狀，此時改用化學限定培養液B培養后部分細胞死亡。11 d左右獲得的細胞胞體基本呈圓形或多角形，直徑6～10μm，細胞核較大，胞質少，突起豐富(圖1)。每皿計數細胞數為(6～8)×105個。

2.2 少突膠質細胞免疫化學染色 培養的細胞行MBP免疫化學染色，90%以上為MBP陽性細胞(圖2)，異質細胞少。

圖1 培養第12天，純化的視神經少突膠質細胞(×100)

圖2 培養第12天，MBP細胞免疫化學染色陽性的少突膠質細胞(×200)

2.3 培養方法的可重復性 3次培養細胞的MBP細胞免疫化學染色陽性細胞百分率分別為(95.33± 3.3)%、(94.33±2.2)%及(97.13±2.2)%，差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

視神經是由視網膜神經節細胞胞體發出的軸索和視神經膠質細胞組成，不含神經元胞體和室管膜細胞，成分單一，便于研究[6]。視神經膠質細胞主要包括星形膠質細胞和少突膠質細胞兩大類，其中星形膠質細胞分為Ⅰ、Ⅱ型星形膠質細胞。星形膠質細胞和少突膠質細胞雖然均起源于神經外胚葉的神經上皮細胞，但2種細胞來自不同的分化譜系，Ⅰ型星形膠質細胞由Ⅰ型星形膠質細胞譜系分化，少突膠質細胞和Ⅱ型星形膠質細胞是由一種普通雙向潛能的少突膠質細胞/Ⅱ型星形膠質細胞祖細胞(oligodendrocyte/type-2 astrocyte progenitor cells，O-2A)分化的。少突膠質細胞對中樞神經系統髓鞘形成起著決定性作用，而Ⅱ型星形膠質細胞的突起總是圍繞著郎飛結，因此O-2A譜系可能對髓鞘形成有特殊的作用[1]。

體外分離培養少突膠質前體細胞，取材時間最好放在其前體細胞充分發育之后，但是要在活躍的髓鞘形成期之前，以保證其能在體外繼續發育。大鼠出生后約1周，少突膠質細胞即逐漸成熟[1]，因此采用新生2 d的SD大鼠視神經進行原代培養。彭錫嘉等[7]采用視神經組織塊加雙蓋玻片法培養少突膠質細胞，將視神經剪碎使細胞容易從組織中游離，但對脆弱的視神經損傷較大，操作也不容易。由于新生大鼠視神經組織較輕，直接加入培養液后，組織塊容易懸浮起來；加雙蓋玻片可幫助神經組織貼壁，但蓋玻片在一定程度阻礙了組織塊與培養液的接觸，不利于細胞生長；如果選用膜性的蓋玻片，成本又很高。本實驗不對組織塊進行剪碎，減少對其損傷，只對組織塊在室溫下稍做消化(3～5 min)后，直接接種于培養皿中，加入少量的培養液，使組織塊既接觸到培養液又不懸浮于培養液，細胞可接觸培養皿底貼壁生長。

前O-2A祖細胞和O-2A祖細胞在血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、神經營養因子-3(neurotrophin-3，NT-3)、胰島素樣生長因子-1(insulin like growth facto-1，IGF-1)等肽類生長因子的作用下可大量增殖，其中PDGF可以刺激少突膠質前體細胞合成DNA，bFGF、NT-3和IGF-1可促進細胞周期循環，阻止細胞分化[8]。星形膠質細胞體外培養可以分泌PDGF和bFGF[9]，其條件培養液具有明顯的促神經生長的作用[10]。因此，盡管血清可誘導O-2A向Ⅱ型星形膠質細胞分化，但本實驗在視神經培養的早期仍使用了含有血清的培養液，但逐漸降低至僅含0.5%胎牛血清的化學限定性培養液。一方面保證一定數量的星形膠質細胞的存活，分泌細胞因子促進O-2A增殖；另一方面盡可能減少O-2A向星形膠質細胞的分化。待獲得足夠數量的細胞后，改為無胎牛血清化學限定性培養液繼續進行培養，此時O-2A在無胎牛血清培養基中，在甲狀腺素、腐胺、黃體酮及微量元素硒的作用下可向少突膠質細胞分化。由于成熟的少突膠質細胞為分裂終期細胞，不再具有分裂增殖能力，因此在無胎牛血清條件下生存不受影響；而星形膠質細胞及成纖維細胞具有分裂增殖能力，在此條件下很難存活[6]。在更換培養液第2天即可觀察到部分細胞死亡，考慮為死亡的星形膠質細胞及成纖維細胞，從而實現了對培養的少突膠質細胞的純化。

體外培養條件下的少突膠質細胞系的發育進展按抗原表達、形態和功能分為前O-2A祖細胞、O-2A祖細胞、原少突膠質細胞、未成熟少突膠質細胞和成熟少突膠質細胞5個階段[11]。少突膠質細胞在形成髓鞘前1～2 d將表達MBP[12]，這種蛋白在中樞神經系統只存在于少突膠質細胞胞體的胞漿面[13]。Mirsky等[14]觀察到，體外培養的視神經在5～6 d時才有MBP陽性的少突膠質細胞出現。本實驗方法所培養的細胞在第11天時，90%以上為MBP陽性細胞，提示均為成熟的少突膠質細胞，細胞數量每皿可達(6～8)×105個，足夠一般細胞生物學實驗使用，且方法簡便、穩定，易于推廣。

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Modified method for ratoptic nerve oligodendrocytes in vitro culture

WANG Xiaohong1，WANG Suping1，CHE Juhua2，WANG Hong3，WANG Tao4，ZHU Yanling5
(1.Department of Neurology，Dalian Municipal Central Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian Liaoning 116033，China；2.Dalian Medical University，Dalian Liaoning 116044 China；3.Department of Neurosurgery，Dalian Municipal Central Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian Liaoning 116033，China；4.Department of Rehabilitation Medicine，Dalian Municipal Central Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian Liaoning 116033，China；5.Department of Neurology，the Third People′s Hospital of Dalian，Dalian Liaoning 116033，China)

ObjectiveTo improve the pastmethod for in vitro culture of neonatal rat optic nerve oligodendrocytes.MethodsSix optic nerves of newborn rats were placed in poly-lysine precoated dish(diameter 3.5 cm)，cultured with 400μL basic culturemedium for 3 days，and then replaced by 400μL chemically defined culturemedium containing 3%foetal bovine serum(FBS). For about the 10th days，culturemedium was replaced by 600μL chemically defined culturemedium without FBS.At the 11st days，immunocytochemistry with myelin basic protein(MBP)was used to identify oligodendrocyte，and the percentage of positive cellswas calculated.Oligodendrocyte in vitro culture with themethod was repeated three times，analysis of variance was used to evaluate the stability of the improved method.ResultsFor the 11st cultured days，number of cells in per dish was up to(6—8)×105，more than 90%cellswere positive with MBP immunocytochemistry.There was no statistical difference among the percentage ofMBP immunocytochemistry positive cells of the three times(P＞0.05)of culture.ConclusionHigher purified and enough for cell biology experiments mature oligodendrocytes can be obtained with the improvedmethod for in vitro culture of neonatal rat optic nerve oligodendrocytes.This improved method is relatively easy and stable，compared with the othermethods for oligodendrocytes culture.

Optic nerve；Oligodendrocyte；Cell culture

R322.85－332

A

2095-3097(2014)06-0330-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2014.06.003

2014-09-25 本文編輯:徐海琴)

116033遼寧大連，大連醫科大學附屬大連市中心醫院神經內科(王曉虹，王蘇平)，綜合神經外科(王 虹)，康復醫學科(汪濤)；116044遼寧大連，大連醫科大學(車菊華)；116033遼寧大連，大連市第三人民醫院神經內科(朱艷玲)

王蘇平，E-mail:wangsuping＠medmail.com.cn