長鏈非編碼RNA在癌癥診斷中的應用

徐飛岳，陳揚超

·述 評·

長鏈非編碼RNA在癌癥診斷中的應用

徐飛岳，陳揚超

人類基因組中蛋白質非編碼基因占大多數，這些非編碼基因與癌癥的發生、發展有密切聯系。非編碼基因轉錄形成的RNA稱作非編碼RNA。其中的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）具有重要的基因調控功能并由此受到重視。由于部分lncRNA在各類型的癌癥中表達異常，因此可以作為癌癥的標志物用以診斷癌癥。本文對lncRNA的分類、基因調控機制以及在癌癥中的作用進行介紹，并對現有的以及部分潛在的癌癥標志物lncRNA進行詳細闡述。隨著基因測序技術及微陣列技術的發展，更多的lncRNA會被發現并且能夠成為重要的診斷腫瘤的標志物。

長鏈非編碼RNA；調控機制；癌癥；基因診斷

很長時間以來，在癌癥研究中編碼蛋白質的基因備受廣泛關注。然而，DNA組分總匯計劃（encyclopedia of DNA element，ENCODE）研究表明，人類基因組中只有少量的基因組能夠編碼蛋白質，多于80%的基因組雖然能轉錄形成RNA，但這些RNA不能進一步翻譯最終形成蛋白質，這些基因組屬于非編碼基因組，由非編碼基因組轉錄形成的RNA被稱作非編碼RNA（non-coding RNA）［1］。

之前，人們認為這部分的非編碼基因組只是一些轉錄噪音，并沒有具體的功能。最新的研究表明，這些非編碼RNA具有基因調控功能［2］；而且在癌癥研究中發現，許多非編碼RNA的表達異常往往與癌癥的發生、發展以及術后恢復有緊密聯系。部分異常表達的非編碼RNA能夠作為癌癥的基因診斷靶點，可以為早期診斷以及判斷癌癥類型提供新的依據。

相較于編碼RNA，非編碼RNA在癌癥診斷中有無可比擬的優勢。編碼RNA在轉錄翻譯過程中會受到各種調控，不能準確反映最終功能產物，即蛋白質的表達水平。而非編碼基因無法翻譯，所受調控相對較少，相對比較準確，并且具有更高的癌癥相關度［2］，可以作為更有效的診斷工具。Cheetham等［3］通過全基因組關聯研究系統分析與癌癥相關的301個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs），得出只有3.3%的SNPs發生在蛋白編碼區域，40%的SNPs發生在蛋白編碼基因的內含子上，另有44%發生在基因間區。由此可見，與癌癥相關的SNPs多發生在非編碼區域，并且可以推斷這些非編碼區域可能轉錄形成非編碼RNA發揮作用。而且，非編碼RNA在體液如血液甚至尿液中可以穩定存在，并能被檢測到［4］。因此，非編碼RNA作為檢測工具，具有方便迅速、減輕患者痛苦的優勢。

根據RNA的大小，非編碼RNA可以分為長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）和短鏈非編碼RNA。一般將大于200 NT的RNA歸為長鏈非編碼RNA，而小于200NT的則稱為短鏈非編碼RNA［5］。短鏈非編碼RNA包括微小RNA（microRNA，miRNA）、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、PIWI蛋白相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）以及小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）［6］。通過實時熒光定量核酸擴增檢測系統檢測miRNA在體內的表達，可以用作癌癥的診斷。有報道認為，miRNA-21就可以作為肝癌的基因診斷標志物［7］。然而，在測定miRNA表達時需要有參考基因對其進行定量分析，研究表明不同的參考基因會對目的基因的輸出有很大影響［8］。目前，人們對選擇何種基因作為內參仍然沒有共識。此外，miRNA的特異性低，很難通過對其進行分析從而確定具體的癌癥［6］。每個miRNA的目標基因平均有500個之多。保守估計，大約60%的mRNA擁有1個或多個可以被miRNA識別作用的保守序列［9-10］。這既表明了作為轉錄調控因子的miRNA調控范圍之廣，但同時也表明miRNA的特異性較低。

隨著下一代基因測序技術以及微陣列技術的發展與應用，大量的lncRNA得以發現和研究［11-13］。據估計，哺乳動物的lncRNA的轉錄子數量遠多于蛋白編碼基因的轉錄子［14］。目前，ENCODE預測的人類基因組lncRNA有9 640個位點，但這只是冰山一角，仍有大量的lncRNA還未發現［6］。與編碼基因相似，lncRNA具有組織特異性表達，染色體標志物以及獨立的基因啟動子［6］；并且相較于miRNA，lncRNA的調控機制相對單一因而特異性更高。因此，lncRNA作為癌癥的基因診斷生物標志物有無可比擬的優勢。

1 lncRNA的功能及調控機制

lncRNA同樣由RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成，經過剪切之后形成成熟的lncRNA。lncRNA可以分為多種亞型，如：長鏈基因間非編碼RNA（long intergenic non-coding RNA，lincRNA）；天然反義轉錄物（natural antisense transcripts，NATs）；轉錄的超級保守區（transcribed ultraconserved region，T-UCR）；假基因（pseudogene）；增強子樣非編碼RNA（enhancer-like noncoding RNA，eRNA）等［15］。與miRNA相比，lncRNA的序列保守度更低，然而lncRNA在細胞內的調控功能更為廣泛。目前研究表明，lncRNA的生物功能包括染色體修飾、轉錄及轉錄后調控、印記、表觀調控、細胞凋亡及細胞周期調控、剪切以及細胞增殖和分化調控等［15］。

lncRNA的分子機制通常歸結為分子信號、分子圈套、分子向導以及支架4種。作為信號，lncRNA忠實地指導轉錄因子與基因組DNA的結合，在時間與空間上調控基因表達。作為分子圈套時，lncRNA與轉錄因子結合并阻止其與基因組DNA結合。在作為分子向導時，lncRNA招募染色體修飾蛋白復合體到達目的基因，從而調控目的基因表達。lncRNA可以與多個蛋白結合形成核糖核蛋白聚合物，可以作為核結構的支架起穩定作用。

lncRNA可以在染色體修飾、轉錄調控以及轉錄后加工的水平上調控相應的蛋白表達基因的表達。在對染色體進行修飾時，lncRNA通過招募相關染色體修飾復合物到目的靶點發揮復合物的催化功能。例如lncRNA-同源異型盒（homeobox，Hox）基因的反義基因間RNA（Hox transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR）可以招募多梳蛋白抑制復合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）到達HoxD位點，PRC2可以使染色體組蛋白H3K27發生甲基化進而導致染色體固縮最終抑制基因表達［16］。在轉錄水平對基因表達調控時，lncRNA具有多種調控機制。lncRNA通過招募RNA連接蛋白進而調控組蛋白乙酰轉移酶使得染色體乙酰化從而抑制轉錄的發生。lncRNA也可以作為轉錄因子的共同催化劑調控相關基因的轉錄。lncRNA還可以與啟動子結合進而抑制轉錄因子與其結合抑制基因的轉錄。對于轉錄后調控，lncRNA可以掩蓋5′端的剪切位點，使得內含子得以保留從而達到選擇性剪接的調控目的［17］。

2 lncRNA可以作為癌癥檢測標志物

現有研究表明，lncRNA與多種腫瘤的生成、發展、遷移等有高度聯系，可以作為診斷的靶點［18］。部分lncRNA在癌癥中異常表達、過度表達或低表達，因此可以根據其表達狀況來診斷癌癥。介紹目前已經批準應用的癌癥診斷標志物lncRNA以及潛在的可以作為標志物的lncRNA。

2.1 美國食品和藥物管理局批準應用的癌癥診斷標志物——前列腺癌抗原3 前列腺癌抗原3（pro-state cancer antigen 3，PCA3）與前列腺癌高度相關，可以用作預測前列腺癌風險，避免前列腺穿刺［19-20］。研究表明，在超過95%的前列腺癌患者中，腫瘤組織中PCA3的表達量是非腫瘤組織的100倍以上［21］，并且在其他組織中沒有發現有PCA3的表達，意味著PCA3與前列腺癌高度相關。雖然早在1999年就已經發現了這一與獨特的、與前列腺癌高度相關并具有選擇性剪接功能的lncRNA，但到目前為止對PCA3在前列腺癌中所發揮的作用依然知之甚少［21-22］。在敲除了PCA3的前列腺癌細胞系LNCaP細胞及PCA3細胞中，發現細胞生長、活性以及雄激素受體信號途徑受到抑制［23］。盡管對PCA3的調控機制不是特別清楚，但不妨礙PCA3在臨床上的成功應用。目前，美國食品和藥物管理局已經批準了PCA3臨床檢測用以代替之前的前列腺特異性抗原分析。主要是由于PCA3檢測的特異性以及靈敏度高，可以快速方便地診斷前列腺癌［20-21］。

2.2 潛在的癌癥診斷標志物lncRNA

2.2.1 腫瘤中過度表達的lncRNA

2.2.1.1 HOTAIR HOTAIR是一種在多種癌癥中過度表達的lncRNA，已經引起廣泛研究和關注。HOTAIR是長2 158 NT的lincRNA，由HoxC轉錄生成，主要作用是招募PRC2及組蛋白賴氨酸特異性脫甲基酶1復合體結合到HoxD位點催化此處染色體組蛋白H3K27甲基化，抑制基因表達［16］。

早在2010年，Gupta等［16］就發現了在乳腺癌中過度表達的HOTAIR，并且可以預測腫瘤的遷移以及患者的存活率。Ma等［24］研究發現，在相對于正常臨近組織HOTAIR在膽囊癌組織表達量明顯升高；而且相對于早期的膽囊癌組織，已經擴散的腫瘤組織的HOTAIR表達量更高。Emadi-Andani等［25］則在胃癌臨床樣本中發現過度表達的HOTAIR與腫瘤臨床分期、嗜神經侵襲以及腫瘤遠距離轉移有正相關性。在肝癌中，HOTAIR同樣過度表達，并且還可以作為肝移植治療后腫瘤再發生的生物標志物［26］。在胰腺癌［27］、鼻咽癌［28］中均發現HOTAIR的過度表達，HOTAIR是成為癌癥標志物的最佳選擇之一。

2.2.1.2 細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子4b位點的反義非編碼RNA 細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子4b（inhibitors of cyclin-dependent kinase 4b，INK4b）位點的反義非編碼RNA（antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL）位于染色體9p21區域，該區域是一個與多種疾病，如心血管疾病、2型糖尿病、阿爾茨海默病等多種疾病［29］相關的熱點區域；同時，發生在該區域的突變也與多種癌癥有關，如白血病、乳腺癌、卵巢癌等［29］。位于該區域的p15INK4b、p14蛋白可選讀碼框（p14 alternate reading frame，p14ARF）和p16INK4a是已知的抑癌基因，廣泛地參與調控細胞增殖、凋亡、衰老等功能［30］。ANRIL作為反義RNA鏈可以抑制相鄰的p15INK4b、p14ARF和p16INK4a基因的表達，進而間接調控細胞增殖、凋亡活動［31］。ANRIL調控相鄰基因的分子機制與HOTAIR相似，都是通過招募PRC1和PRC2達到指定基因的染色體位點，最終導致染色體固縮抑制基因表達。

研究表明，ANRIL在胃癌中過度表達，并且高表達的ANRIL與高臨床腫瘤分期和較大的腫瘤有高度相關性，同時高表達的ANRIL預示著較差的術后恢復效果［32］。在白血病患者中ANRIL也有過度表達，并且伴隨著抑癌基因p15的沉默［33］。在胰腺癌中也有發現ANRIL的高表達［34］。

2.2.1.3 肺腺癌轉移相關轉錄因子1 肺腺癌轉移相關轉錄因子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）長度約為8 000 NT，在人類正常組織中有廣泛分布［35］。研究表明，MALAT1可以調控細胞的遷移。在肺腺癌細胞中的MALAT1敲除以后，遷移相關的基因表達受到影響，同時細胞的遷移受到抑制［36］。MALAT1的調控機制沒有完全被理解，但研究認為MALAT1通過調控絲氨酸／精氨酸剪切因子磷酸化進而調控選擇性剪切。MALAT1敲除以后會導致部分剪切因子的位置和活性的改變，并產生一系列的具有不同剪切位點的pre-mRNA［37］。

MALAT1首次在非小細胞肺癌中發現并進行報道。高表達的MALAT1被認為與腫瘤的高轉移率以及低的術后存活率相關［35］。盡管在正常組織中也能檢測到MALAT1的表達，但在肝癌、乳腺癌、胰腺癌、骨肉瘤、結腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮內膜間質肉瘤以及前列腺癌中，MALAT1的表達量相對于正常組織有明顯升高［38］。目前，MALAT1已經作為肝移植手術的預后因子，用以預測腫瘤的發生［39］。

2.2.1.4 H19 H19是長度約為2 300 NT的lncRNA，在生長發育的基因組印記發揮很大的作用。H19在成熟組織的再生在腫瘤發生過程中可以再次激活［40］。致癌基因c-myc能夠在多種細胞中誘導H19的表達［41］。也有研究表明，由腫瘤造成的低氧以及p53突變型能夠激活H19的表達［42］。在結腸直腸癌中miRNA-675能夠抑制抑癌基因RB1，而H19可以作為miRNA-675的前體，因此H19和miRNA-675被認為是致癌基因［43］。H19也能直接調控并抑制其反義鏈上的基因——H19對立腫瘤抑制基因（H19opposite tumor suppressor，HOTS）的表達，而HOTS被認為是一種抑癌基因可以抑制腫瘤的生長［44］。研究表明，H19調控的基因與腫瘤細胞的遷移、血管生成以及新陳代謝相關［45-46］。在肝癌［47］、胃癌［48］、胰腺癌［49］、結腸癌［2］、膀胱癌［50］中都能檢測到過度表達的H19。

2.2.1.5 肝癌細胞高表達 肝癌細胞高表達（highly upregulated in liver cancer，HULC），從名稱就可得知HULC與肝癌特異性相關。研究表明，HULC不僅與肝癌以及有肝轉移能力的結腸直腸癌相關，而且在乙型病毒性肝炎病毒導致的肝癌細胞中表達量較高，表明HULC可能與乙型病毒性肝炎病毒感染導致的癌癥有密切的聯系［51］。作為潛在的生物標志物，HULC可以穩定存在于血液中，并能夠被檢測到［52-53］。HULC長度約為500 NT，包含2個外顯子，位于染色體6p24.3，類似于mRNA但已研究證實是非編碼RNA［52］。HULC的調控機制是作為miRNA-372的分子圈套，與miRNA-372結合阻止其與蛋白激酶A催化亞單位β（protein kinase A catatytic subunit beta，PRKACβ）結合。PRKACβ是cAMP反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）的激酶，激活CREB的活性。CREB激活后又會通過保持HULC啟動子的染色體結構的開放從而促進HULC的轉錄［54］。

2.2.2 腫瘤中下調的lncRNA

2.2.2.1 母系表達基因3 母系表達基因3（materally expressed gene 3，MEG3）是第1種被定為抑癌基因的lncRNA。MEG3位于染色體14q32.2上，共有10個外顯子［55］。根據不同的剪切方式現已檢測到12個亞型，最早發現的亞型的長度約為1 600 NT［56］。MEG3在正常組織細胞中大量表達，特別是在大腦和腦垂體。不僅在腦癌中而且在其他多種癌癥中都發現MEG3的表達量下降甚至無法檢測到［57-58］。研究表明，在腎細胞癌和上皮性卵巢癌中，MEG3表達受到抑制是由于啟動子發生了甲基化所致［59-60］。在垂體瘤的臨床樣本中也發現MEG3基因高度甲基化抑制了MEG3的轉錄［61］。在胃癌中，MEG3在腫瘤中的表達水平顯著下降，并與臨床腫瘤分期、腫瘤侵襲深度以及腫瘤大小相關，并且低表達量的MEG3預示著不良預后［62］。異位表達該基因可以明顯觀察到多種癌細胞系的生長受到抑制，并且p53蛋白含量上升以及p53下游靶點被激活［61］。

2.2.2.2 lncRNA-p21 lncRNA-p21在基因組的位置與細胞周期調控基因CDKN1A相鄰，大小約為3 100 NT。lncRNA-p21是由p53直接激活并在p53的轉錄應答時發揮重要作用。在p53轉錄網絡中，lncRNA-p21通過調控mRNA轉錄和蛋白的穩定來實現其功能。lincRNA-p21通常需要與核不均一核糖核蛋白K（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，hnRNPK）協作共同激活p53相關基因，如p21的轉錄。此時，lncRNA-p21發揮的作用與p53這種抑癌基因相似。最新研究發現，在lncRNA-p21缺陷型老鼠中，多梳蛋白目的基因的改變，表明lncRNA-p21與多梳蛋白有一定的聯系［63］。lncRNA-p21與RAN連接蛋白HuR結合時會招募let-7／Ago2與lncRNA-p21結合，而let-7／Ago2會導致lncRNA-p21的穩定性下降［64］。

在對結腸直腸癌患者檢測時發現，相對于正常組織，lncRNA-p21在腫瘤組織中的表達量明顯下調，而且在直腸腫瘤中的lncRNA-p21表達量要高于在結腸的腫瘤。研究還發現，在Ⅲ期腫瘤中lncRNA-p21的表達量要高于Ⅰ期腫瘤［65］。因此，lncRNA-p21不僅可以預測癌癥，而且與癌癥發展也存在一定關聯。鑒于lncRNA-p21在p53調控網絡中所起的作用，lncRNA-p21可以成為潛在的診斷靶點。

2.2.2.3 GAS5 GAS5的轉錄單位包括了12個外顯子，長度約為7 000 NT，并可形成snoRNA。GAS5通過調控細胞的糖皮質激素的活性來應答營養物的缺乏，進而抑制細胞的生長以及提高細胞對凋亡的敏感性。在調節過程中，由于糖皮質激素受體屬于轉錄因子，因此GAS5可以作為分子圈套，直接作用于糖皮質激素受體的DNA結合位點，從而阻止糖皮質激素受體與對應的反應元結合，進而調控細胞的新陳代謝。現有研究表明，在直腸癌細胞及直腸癌組織中，p53基因可以直接調控GAS5，GAS5衍生的snoRNA可以直接應答DNA損害［66］。也有研究表明，在非小細胞肺癌細胞系及腎細胞瘤細胞系中，過度表達GAS5可以導致腫瘤細胞在體內及體外生長受到抑制并且引起凋亡［67-68］，同時用siRNA敲除掉GAS5后則會促進肺癌［67］、膀胱癌［69］及胰腺癌［70］的腫瘤細胞生長。由于GAS5直接抑制細胞的快速生長，因此在多種癌細胞，如惡性胸膜間皮瘤［71］、腎癌［72］、非小細胞肺癌［67］中均能發現其表達量有明顯下降。在胃癌腫瘤樣本中，GAS5的表達量明顯下降，低表達量的GAS5預示著較低的無病生存率和存活率［73］。

3 總結與展望

眾所周知，癌癥作為人類頭號殺手之一，目前仍然沒有特效藥物可以直接治愈。而早期發現并采取措施是可以有效避免癌癥或提高癌癥治愈率。如今已有部分lncRNA得以發現并被證明能夠在癌癥中發揮重要的調控作用。在癌癥中，部分表達失調的lncRNA被認為可以作為潛在的生物標志物，用來對癌癥進行早期預警診斷［15］。已經批準的并商業化的PCA3檢測的應用也預示著lncRNA在癌癥診斷中會有更大的發揮空間。

癌癥生物標志物，應該具備能夠簡單快速檢測以及與癌癥緊密相關的特點。由于RNA在體液中可以方便地檢測到，許多RNA與癌癥息息相關，因此可以作為理想的生物標志物。其中，腫瘤相關miRNA由于穩定性高，并且可以在癌癥患者的血液、尿液中檢測到，因此研究較多。但如前所述，miRNA仍存在一些缺陷，尤其是腫瘤特異性不高，會限制其在腫瘤診斷中的應用。lncRNA近年來才受到重視，相對于miRNA，目前發現的與癌癥相關的lncRNA數量依然偏少。雖然部分lncRNA已經被深入研究，其功能以及與癌癥的關系基本確定［74-76］，但總體lncRNA的數量依然偏少。借助于轉錄組基因測序以及微陣列技術，將會有更多的lncRNA得以發現并研究，lncRNA這座巨大的寶庫也將逐步展現于世人面前；而且在臨床上可以用定量聚合酶鏈反應技術簡單快捷地檢測lncRNA的表達，為其進一步推廣創造了條件。鑒于lncRNA在癌癥發生中所起的調控作用，相對專一的調控機制產生的較高的特異性，以及穩定地存在于體液中的特性［77-79］，可以判斷lncRNA作為癌癥標志物愈發顯得有必要。

作為癌癥的診斷標志物，lncRNA仍有許多問題需要研究。lncRNA的穩定性如何以及在各種癌癥中不同階段的穩定性變化狀況，lncRNA表達量的變化是癌癥的因還是果的關系，lncRNA與癌癥的特異性，以及lncRNA作為檢測標志的標準等問題都需要不斷研究。一些lncRNA不僅與癌癥相關，而且其他疾病中也能發現其表達異常［80］，這就增加了誤診的可能性。所以，就未來基因診斷而言，既需要對大量的臨床樣本進行統計研究，也需要將miRNA、lncRNA以及mRNA等多種標志物結合，以提高基因診斷的準確性。

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陳揚超博士簡介

香港中文大學醫學院生物醫學學院博士生導師，主要從事胃腸腫瘤分子生物學、基因表達調控以及蛋白質組學研究，主持香港特區政府健康與醫藥類、香港-美國合作研究基金項目10余項，獲研究經費700余萬元，在Cancer Res、Gastroenterology、Hepatology、Proteomics、JMol Biol等雜志發表學術論文60余篇；現為國家自然科學基金委員會評審專家，Cancer Lett、PLos One、Life Sci、Anticancer Drugs、BMC Med Genomics等多家國際期刊特約審稿人。

Long non-coding RNA，potential biomarkers of the cancer diagnosis

XU Feiyue，CHEN Yangchao
（School of Biomedical Sciences，Faculty of Medicine，the Chinese University of Hong Kong，Hong Kong 999077，China）

Large numbers of the genomic transcripts do not encode proteins but play critical role in development and progress of cancer.Those non-coding transcripts are called non-coding RNA.Among the non-coding RNA，the long non-coding RNA（lncRNA）are increasingly recognized as participators of gene regulation.Parts of the lncRNA are found to be dysregulated in cancer and believed to be potential biomarkers for cancer diagnosis.In this paper，the classification，regulation mechanisms and biological functions of the lncRNA are introduced.Besides，some existing and potential biomarker lncRNA are also elaborated here.More lncRNA will be investigated and become the significant biomarkers for cancer diagnosiswith the advancement of gene sequence and microarray technologies.

Long non-coding RNA（lncRNA）；Regulation mechanisms；Tumor；Gene diagnosis

Q522；R73

A

2095-3097（2014）05-0257-08

10.3969／j.issn.2095-3097.2014.05.001

2014-07-18 本文編輯：徐海琴）

999077香港，香港中文大學醫學院生物醫學學院（徐飛岳，陳揚超）