一例櫻桃谷種鴨坦布蘇病毒病與呼腸孤病毒病混合感染的診斷

謝海軍 傅光華※ 陳紅梅 萬春和

（1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所福州350013；2.江西省贛州市章貢區農業和糧食局能源辦贛州341000；3.江西省贛州市章貢區農業和糧食局動物防疫檢疫站贛州341000）

一例櫻桃谷種鴨坦布蘇病毒病與呼腸孤病毒病混合感染的診斷

劉偉1林貴富2謝海軍2蔡小敏3傅光華※1陳紅梅1萬春和1

（1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所福州350013；2.江西省贛州市章貢區農業和糧食局能源辦贛州341000；3.江西省贛州市章貢區農業和糧食局動物防疫檢疫站贛州341000）

江西省贛州地區某種鴨場櫻桃谷種鴨發生一起以產蛋下降、個別死亡、卵泡出血和肝臟、脾臟表面有白色壞死點為主要特征的疫病，我們設計特異性引物并以建立的PCR、RT-PCR方法對該病例樣品分別進行了禽流感病毒、鴨坦布蘇病毒、禽多殺性巴氏桿菌、鴨呼腸孤病毒、產蛋下降綜合征病毒、副粘病毒和鴨瘟病毒的檢測，結果僅擴增出約330 bp大小的鴨坦布蘇病毒特異性條帶和約680 bp大小的鴨呼腸孤病毒特異性條帶，結合臨床剖檢病變和實驗室檢測結果，確診該病例為鴨坦布蘇病毒病與呼腸孤病毒病合感染。

鴨坦布蘇病毒病呼腸孤病毒病混合感染診斷

鴨坦布蘇病毒病是2010年4月以來發生的一種新鴨病，以采食量迅速下降，產蛋率急劇下降、甚至停產及出現不同程度死亡為主要特征，各品種鴨均有發生。不同地區、不同品種鴨群發病率高低不一，群內發病率幾乎為100%，病死率為5%～15%[1-5]。目前，該病的確診有賴于實驗室的檢測[6]。

鴨呼腸孤病毒病是由呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬番鴨呼腸孤病毒引起番鴨、半番鴨、櫻桃谷鴨、麻鴨等一種病毒性傳染病。該病主要發生于40日齡內番鴨，臨床上以肝、脾、腎表面有白色壞死點為主要病變，其發病率高，死亡率為10%～50%[7-10]。現將一例櫻桃谷種鴨發生鴨坦布蘇病毒病與鴨呼腸孤病毒病混合感染的診斷報道如下。

1 發病情況及臨床癥狀

2013年3月，江西省贛州地區某種鴨場飼養的253日齡、近3 500羽櫻桃谷種鴨突然發病，采食量明顯下降，患鴨體表、兩腳發熱，發病一周后產蛋率從發病前的89%左右下降到40%，個別患鴨軟腳或雙腳麻痹，一周內死亡種鴨41羽，病死率1.17%。

2 剖檢病變

剖檢病死鴨，主要見肝臟、脾臟表面有數量不等的白色壞死點，卵泡嚴重出血，甚至有的卵泡破裂、卵黃液化流入腹腔中。

3 診斷

3.1 實驗室檢測

3.1.1 病料采集自病死鴨中無菌采集肝臟（一部分用于細菌分離）、脾臟和出血卵巢，按常規方法勻漿，反復凍融數次，4℃條件下10 000 r／min離心15 min，無菌吸取上清液，于220 nm孔徑的濾膜過濾后于-20℃凍存備用。

3.1.2 細菌分離與鑒定用滅菌鉑耳從采集的肝臟樣品中挑取少量樣品，在血瓊脂平板上劃線培養，然后將平板倒置于37℃恒溫箱培養24 h，未觀察到任何細菌生長，則可排除細菌感染。

3.1.3 病毒檢測

3.1.3.1 主要試劑RNA提取試劑盒購于TIANGEN有限公司（北京）；AMV反轉錄酶、RNA酶抑制劑Ribonuclease Inhibitor、DL 2000 DNA Marker等試劑均購于寶生物工程（大連）有限公司；DNA提取試劑盒，dNTP Mix、Fast Pfu fly DNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司。

3.1.3.2 引物設計根據GenBank提供的禽流感M基因、鴨坦布蘇病毒NS5基因、鴨呼腸孤病毒M3基因、產蛋下降綜合征病毒PⅧ基因、副粘病毒F基因和鴨瘟病毒UL基因的序列，分別設計特異性引物，由生工（上海）生物工程有限公司合成。

3.1.3.3 核酸提取和病料處理取凍存的病料上清液，分別按病毒RNA提取試劑盒操作說明書和病毒DNA提取試劑盒操作說明書提取病料的組織病毒DNA。將其中提取的病毒RNA反轉錄合成cDNA（具體操作參照AMV反轉錄酶使用說明書），反轉錄的引物為6堿基隨機引物，反轉錄合成的cDNA放置于-20℃保存備用。

3.1.3.4 病毒檢測從處理好的待檢樣品中，可擴增出約330 bp的與預期大小相符的鴨坦布蘇病毒特異性條帶（見圖1），對測序結果比對分析發現，與我國ZJ 407株，ZJ-6株及ZJ GH-2株鴨坦布蘇病毒NS5基因同源性高達99%，則確定為鴨群感染鴨坦布蘇病毒病。

另同時從處理好的待檢樣品中，可擴增出約680 bp與預期大小相符的鴨呼腸孤病毒特異性條帶（見圖2），對測序結果比對分析發現，與AVS-B株鴨呼腸孤病毒的同源性最高達99%，而與919株和S1133株雞源呼腸孤病毒核苷酸同源性較低為86%，則可確定為鴨群也感染鴨呼腸孤病毒病。

圖1 鴨坦布蘇病毒檢測結果（1：陽性對照；2：待檢樣品；M：DL2000DNA Marker）

圖2 呼腸孤病毒檢測結果（1：陽性對照；2：待檢樣品；M：DL2000DNA Marker）

3.2 診斷根據發病情況、臨床癥狀和剖檢病變，結合實驗室檢測結果，確診該病為鴨坦布蘇病毒病與呼腸孤病毒病混合感染。

4 分析與體會

1）鴨坦布蘇病毒病發病突然，傳播快速，可感染蛋鴨、種鴨、蛋雞和鵝[11]。在臨床上主要表現為采食量突然大幅下降，產蛋率驟降，由高峰期的90%～95%下降至5%～10%。發病率可高達100%。在該病流行的早期，患鴨一般不出現神經癥狀；而在流行的后期，神經癥狀明顯，表現癱瘓、行走不穩、共濟失調。具有神經癥狀的發病鴨可見腦膜出血，腦組織水腫[12]。

2）呼腸孤病毒病主要發生于肉鴨，種鴨中很少見到，臨床上以軟腳、腹瀉、生長障礙為主要癥狀，以肝、脾表面壞死等為主要病變。耐過鴨生長發育緩慢，成為“僵鴨”。

3）近年來，養鴨生產中疫病流行常呈現混合感染，兩種甚至多種疫病同時發生，通過臨床表現以及病理變化已難以確診，常需進行實驗室檢查。由于H5亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、鴨坦布蘇病毒、產蛋下降綜合征病毒、禽I型副黏病毒、呼腸孤病毒等都能引起鴨產蛋下降[13-14]。因此，對于該病例以設計的特異性引物對其分別進行檢測，結果鴨坦布蘇病毒和呼腸孤病毒呈現陽性，表明是鴨坦布蘇病毒病與呼腸孤病毒病混合感染，提示呼腸孤病毒在種鴨也有感染。

[1]萬春和，黃瑜.坦布蘇病毒致病特性及其流行病學[J].動物醫學進展，2011，32（12）：116-118.

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B

1003-4331（2014）04-0070-03

現代農業產業技術體系建設專項資金資助（CARS-43）。

劉偉（1989-），男，碩士研究生，從事動物病原與分子生物學研究（E-mail：756149217@qq.com）。

傅光華（1977-），男，副研究員，從事動物分子病毒學研究（E-mail：fuyuan1981@gmail.com）。