手術法克隆豬胚胎移植研究

蒙小云 ，鄭 華 *，李 勇，夏代剛 ，竇紅偉 ，石 偉 ，田家寧

（1. 深圳市農牧實業有限公司，深圳 518023；2. 深圳華大方舟生物技術有限公司，深圳 518083）

本研究旨在優化克隆豬胚胎移植技術，力求降低操作成本、提高效率和簡化操作，推進克隆豬試驗向產業化應用邁進。豬的克隆相對于牛羊等家畜難度大，直到2000年才獲得世界首例體細胞克隆豬。國內外已開展了不少克隆豬試驗，豬的克隆效率基本維持在1%～2%。胚胎移植成功率是影響克隆豬效率的主要因素。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗中所需材料包括：斷奶發情母豬、培育好的克隆胚胎數枚、無菌操作實驗室、手術臺、手術麻醉系統一套、手術刀、縫合針線等。要求試驗母豬單獨飼養，術前清潔并徹底消毒；移植的胚胎要求發育良好，嚴格按照恒溫38.5 ℃保存；手術前對手術室進行24 h紫外線照射處理；對手術人員手術前做好消毒凈化工作；手術所用的刀具、耗材做好消毒滅菌工作。確保胚胎移植過程處于無菌操作。

1.2 胚胎的建系及選擇

1.2.1 供體的選擇

在試驗開始前，根據公司種豬群育種數據，選擇遺傳指數高的，生產性能好的公豬作為此次試驗的供體。

1.2.2 體細胞采樣

保定好供體，采樣人員對供體耳緣周邊進行消毒清理，剃掉皮膚上層的絨毛，用采樣器剪取0.5 cm×0.5 cm的耳肉，裝入樣品管，放入專用冷凍箱保存。

1.2.3 胚胎建系

將采好的樣品送至深圳華大方舟生物技術有限公司進行胚胎建系。

1.2.4 胚胎選擇

建好胚胎系之后，胚胎挑選原則是盡量選取形態良好、擴張充分、內細胞團明顯的囊胚。

1.3 胚胎受體的選擇

胚胎受體的選擇主要關注以下幾方面：分娩過程長短正常、異常仔豬少、產后恢復快、未有子宮炎癥狀及奶水好的母豬，同時選擇斷奶發情要在7 d以內的母豬，而且發情癥狀要很明顯。

1.4 移植時間

1.4.1 受體斷奶時間

在確定了手術移植時間后，反推母豬斷奶時間，即手術時間反推5 d為發情日期，發情日期反推6 d為斷奶日期。

1.4.2 移植胚胎發育日齡

經過手工克隆出來的，發育6 d的胚胎。

1.5 手術前的準備工作

1.5.1 移植胚胎的準備

用專門的揀胚器對擬移植的胚胎進行分揀并裝入麥管，每頭受體母豬準備2個麥管，每個麥管大約裝入30枚胚胎。將裝好胚胎的麥管放入恒溫的運輸箱。

1.5.2 受體母豬

對斷奶母豬進行斷奶后優飼，確保受體母豬發情良好，發情后對受體母豬實行單欄飼養，術前做好清洗及消毒工作，手術前12 h禁食。

1.5.3 手術儀器準備和檢查

準備手術器械，紗布鍋，手術服，外科手術手套、口罩、縫線、洞巾、磺胺、生理鹽水、碘酊、酒精、酒精棉。對所有進入手術室的器材都要進行滅菌處理。首先確定手術需要幾套滅菌器材，滅菌前用洗潔精清洗器材，然后通過高壓蒸汽鍋進行高壓高溫滅菌；高壓蒸汽鍋在103.4 kPa蒸汽壓下，溫度達到121.3 ℃，維持15～20 min，即可達到滅菌的效果；已滅菌的物品做好標記，與未滅菌的物品分開保存，以免弄錯。

1.6 克隆豬胚胎的移植手術

1.6.1 先期麻醉及固定

肌注受體母豬8～10 mL阿托品，抗痙攣，15 min后靜脈注射舒泰50，體重小于等于150 kg使用2～2.2 mL，大于150 kg使用2.2～2.8 mL。然后將受體母豬固定到手術架上；在手術過程中為了維持麻醉狀態，我們使用動物麻醉機來達到這個效果。動物麻醉機的原理是結合氧氣和笑氣的混合氣體以及揮發性異氟烷來維持麻醉作用。通過這種辦法使受體母豬在整個手術過程中處于麻醉狀態，方便了手術操作。

1.6.2 開腹手術

步驟1：鋪開洞巾，用4個持巾鉗固定于皮膚表面，避免夾到乳頭，影響后期泌乳。

步驟2:在倒數第2、 3個乳頭之間，用手術刀切開皮膚及皮下結締組織，準備止血紗布和止血鉗用以較小血管止血，提前準備非吸收性外科縫線，時刻準備對較大出血血管進行結扎。

步驟3：用止血鉗或手術刀沿腹白線進行分離脂肪層。

步驟4：分離脂肪層直至腹膜，切開腹膜。

步驟5：紗布攤開，上面噴灑一定量的生理鹽水，防止子宮脫水。

步驟6：從腹腔引出子宮，檢查卵巢的排卵情況，遇到排卵時間過早或過晚或子宮粘連嚴重的情況時，需放棄移植，更換受體。

步驟7：找到宮管結合處，用滅菌鈍性針頭扎一個小孔，整個過程要適時向子宮噴灑生理鹽水，保持子宮濕潤，不致脫水。

步驟8：用移植導管將胚胎緩慢輸入子宮角，然后用手指或止血鉗夾持小孔一段時間，防止出血。

步驟9：另一側子宮同上進行。

1.6.3 縫合

胚胎注射完畢后，需要對受體母豬進行術部縫合，具體步驟如下：

步驟1：止血紗布清除手術部位的血漬，將子宮還原入體內，在腹腔內加少量的生理鹽水清洗腹腔，在腹腔內灌入右旋糖酐50 mL和2:160萬單位青霉素。

步驟2：采用連續縫合法用吸收性外科縫線對腹膜進行縫合，縫合時，針間距不宜過大，過大會導致腸管露出腹腔發生疝氣，以小于1 cm為宜。

步驟3：同樣方法對肌肉層和脂肪層進行縫合，撒磺胺，進行消炎。

步驟4：用非吸收性縫線縫合皮膚層，采用結節性縫合。

步驟5：縫合完畢，用手術鑷將縫合部位皮膚外翻，便于愈合，手術鑷夾碘酊消毒手術部位。

步驟6：關掉麻醉罐，為保證麻醉動物安全，可繼續通氧氣，輔助呼吸一段時間。

1.7 術后管理及觀察

待受體母豬完全清醒后，單獨飼養管理，視傷口愈合情況決定是否需要相應治療。如恢復良好，按照配種后1個月母豬標準進行飼養管理，在28 d時通過B超進行查孕，確定受體是否懷孕。

2 結果與分析

2012年10月-12月，我們用手術法共開展16頭母豬的克隆豬胚胎移植試驗（表1）。結果14頭手術法移植的母豬全部陸續返情，移植分娩率僅為12.5%（2/16），一窩產了3頭木乃伊，另一窩產了3頭活仔和1頭木乃伊，移植效果不理想。

2013年6月，我們根據手術法改進方案開展了8頭母豬的克隆豬胚胎移植試驗，此輪受體代孕母豬全部選用了長白經產母豬，8頭豬分娩了4窩，其余4頭母豬返情。本輪手術法移植分娩率為50%（4/8），共分娩26頭活仔和4頭死胎，窩均分娩6.5頭活仔和1頭死胎，移植效果比較理想。

2013年6月根據改進方案手術移植的母豬有4頭過了一個情期沒有返情，而且用超聲波檢測已經懷孕，堅定了我們對試驗成功的信心。于是，8月8日和8月18日我們又手術法移植了2頭母豬，結果分別于11月24日和12月5日分娩，分別分娩8頭和4頭活仔，分娩率達到了100%(2/2)，窩均分娩6頭活仔。

綜合2013年6—8月的手術法胚胎移植結果，10頭受體母豬合計分娩率達到60%（6/12），窩均分娩活仔6.33頭（38/6）。

3 討論

影響豬克隆試驗成敗的因素很多，吳蓉花等綜述了提高豬胚胎發育能力和克隆效率的研究進展。本試驗通過不斷摸索和總結，優化了胚胎移植操作，逐步提高了胚胎移植成功率。主要的優化措施包括：

表1 第1批手術法克隆豬胚胎移植試驗結果

表2 改良后手術法克隆豬胚胎移植試驗結果

2.1 胚胎建系的優化

供體采樣時，樣本是否被污染，以及供體本身的年齡、健康狀況等因素對胚胎的建系和發育都有一定的影響，考慮到以上因素，在后面的供體采樣時我們分別嘗試了皮下脂肪采樣以及胎豬采樣，從建系的情況來看，明顯的優于耳緣采樣。

根據之前采樣及移植情況來看，供體體細胞采樣受供體本身發育情況、體細胞分化及甲基化影響、樣本保存運輸情況等因素影響較大，結合這些情況我們通過采取30 d懷孕母豬的胚胎，作為體細胞提取樣本，能大大的優化胚胎的建系成功率。

2.2 受體選擇的優化

對有子宮炎癥，有子宮粘連、水腫、發育不理想等的受體母豬應放棄移植。由于我場兼顧生產，在選擇受體母豬時沒有太過嚴格地篩選，實驗個體水平參差不齊，這是導致第1批移植試驗成功率低的主要原因。從第2批胚胎移植開始，在選擇受體時，盡量選擇年齡適中、生命力旺盛、分娩時無異常產仔、子宮產后恢復良好、產房無發病情況、哺乳性能良好、斷奶發情時間準確、發情特征明顯的母豬。

2.3 手術操作的標準化

手術法開展胚胎移植，任何細微的不當操作都足以導致胚胎無法著床和死亡。本試驗通過摸索總結出了一套手術法克隆豬胚胎移植操作標準，雖然目前僅僅是企業標準，相信通過不斷修訂和完善，可逐步上升成行業標準。

2.4 術后管理的優化

手術后，胚胎進入受體子宮內，能否著床及發育，這與受體子宮的內部環境、激素分泌、營養狀況以及疾病的影響是分不開的。術后對受體母豬的飼養管理應細致，注意觀察受體母豬手術恢復情況，有無被感染，是否需治療，母豬飼喂料量應根據母豬體況適當調整。細致的管理是保障克隆胚胎在子宮內著床及發育的關鍵因素。