復方紫花地丁對鴨大腸桿菌耐藥質粒的消除作用

余建國 金華職業技術學院浙江金華 321007

復方紫花地丁對鴨大腸桿菌耐藥質粒的消除作用

余建國 金華職業技術學院浙江金華 321007

以復方紫花地丁制劑為消除劑、十二烷基硫酸鈉為對照組消除劑，以鴨大腸桿菌耐藥菌株為靶細菌，進行耐藥質粒體外消除試驗，通過質粒DNA抽提及瓊脂糖凝膠電泳方法，觀察紫花地丁注射液對該耐藥菌株質粒的影響。結果提示：復方紫花地丁制劑對耐藥鴨大腸桿菌作用24 h，其1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC的消除率分別為6.9%、8.6%、10.2%；延長作用時間至48 h，其1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC的消除率分別為7.1%、8.9%、11.3%。結果表明：復方紫花地丁制劑對鴨大腸桿菌耐藥質粒有消除作用。在一定濃度范圍內，劑量與功效呈反比。

復方紫花地丁 耐藥質粒 鴨大腸桿菌 消除

鴨致病性大腸桿菌（duck pathogenic Escherichia coli）是危害養鴨業的最重要的病原之一。由于抗菌類藥物在養殖業中的濫用，導致大腸桿菌存在廣泛的耐藥性。細菌產生耐藥的機制十分復雜，根據耐藥狀況，細菌耐藥分為兩類：第一類，即單一耐藥因素，細菌對一類抗菌藥物的所有種類都耐藥；第二類，多重耐藥性，因質粒或染色體介導的耐藥因素，使細菌對多類抗菌藥物耐藥[1]。

目前，致病性大腸桿菌耐藥性的解決途徑主要有以下幾種：一是減少抗菌藥物的使用并保護現有藥物。二是開發膜通透性較好的藥品，使藥物的內流速度大于外排；此外，研制大腸桿菌多重耐藥的抑制劑及替代產品等工作也在進行中。解決耐藥性問題是一項復雜、持續而艱巨的任務，且部分工作耗資巨大，按照我國的現狀，這項工作依然任重道遠。將耐藥質粒從宿主菌中消除，使其恢復對抗生素的敏感性，是臨床治療多重耐藥菌感染的新思路。

國內外有人利用理化因素和中藥對耐藥質粒進行消除，質粒消除后細菌的耐藥性也隨之喪失，并且不再恢復，但理化因素對機體毒副作用較大，而中草藥由于毒副作用小、價格便宜及體內使用安全而備受重視[2]。中藥制劑的開發和研究是諸多途徑中逐漸引起學者重視的一種，藥理學研究提示：部分中藥及其提取物可以減弱甚至逆轉細菌的耐藥性。已經證實有抗菌作用的中藥黃芩、黃連、金銀花、三黃片等也能降低細菌的耐藥性。一般認為中藥逆轉細菌耐藥性的機制，包括R質粒的消除作用；抑制藥物的主動外排泵、抑制β內酰胺酶活性等[3]。

紫花地丁（Herba Violae）為堇菜科（Violaceae）植物紫花地丁（Viola yedoensis Makino）的干燥全草。藥理作用學研究提示：紫花地丁中所含內酯具有抗炎及體外抑菌作用[4-5]。

本試驗究按照祖國傳統醫學中君丞佐使的配伍原則，以紫花地丁為主，輔以金銀花、野菊花、蒲公英等，按一定比例配制成復方紫花地丁制劑。并選取該制劑作為消除劑，對鴨大腸桿菌耐藥質粒進行體外消除試驗，研究復方紫花地丁制劑對耐藥質粒的消除作用，為臨床上有效治療鴨大腸桿菌病提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑復方紫花地丁制劑，由紫花地丁、金銀花等藥物制備，含生藥1 g/mL，自制。十二烷基硫酸鈉（SDS）：購于上海市化工試劑廠，批號20130822。藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.2 培養基Chapman's培養基：含蛋白胨10 g/ L、牛肉膏1 g/L、氯化鈉75 g/L、瓊脂18 g/L、甘露醇10 g/L、1 g/L酚紅溶液25 mL，pH7.4。麥康凱瓊脂、營養肉湯、營養瓊脂及瓊脂粉等，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 菌株鴨源性大腸桿菌標準菌株K88，福建省農業科學院提供，質控對照菌株ATCC29213購于中國獸藥監察所。

耐藥菌的誘導：取過夜生長的敏感細菌K88培養液0.1 mL，涂于含1/2 MIC恩諾沙星的普通瓊脂平板上，37℃培養16～18 h，挑取平皿上的單個菌落于營養肉湯中37℃培養過夜，次日取0.1 mL的培養液涂于含1MIC恩諾沙星的普通瓊脂平板上，重復上述過程并不斷增加平皿中恩諾沙星的濃度，直至細菌的MIC值提高至≥8.0 ug/mL。測定所得菌株的MIC，并經過三次平皿傳代培養，證實為非適應性生長后保存備用，將該菌編為K881。

1.2 耐藥性消除試驗

1.2.1 質粒體外消除試驗試驗組：將K881菌株接種于營養肉湯中，37℃培養過夜，再接種于Chapman's培養基上培養24 h，挑取瓊脂表面生長良好的單個菌落，混懸于營養肉湯培養基中，37℃培養12 h，調整菌液濃度到1×106CFU/mL，備用[6]。取100 μL菌液分別加入含不同濃度中藥制劑的培養基中（制劑起始濃度為1 g/mL，依次二倍稀釋至第7管，第8管不加藥物作為菌液對照，第9管不加菌液作藥物對照，第10管只加肉湯作空白對照），每管液體培養基總量1 mL。

37℃培養24 h和48 h，判定亞抑菌濃度。分別取24 h和48 h的1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC的3管菌液100 μL進行稀釋，接種Chapman's培養基，涂勻后37℃培養24～48 h，取50 mL培養物劃線接種于普通平板，37℃培養16～18 h。待長出單個菌落后，用滅菌牙簽挑取500個菌落，以影印培養法，對應點種于含恩諾沙星藥物不同濃度平板上和不含藥物的普通平板上，37℃培養24 h，觀察并記錄結果。

對照組：取K881菌液20 uL，接種于含亞抑濃度消除劑（SDS，亞抑菌濃度根據文獻為100 ug/mL）的營養肉湯中，37℃培養24～48 h，取50 mL培養物劃線接種于普通平板，37℃培養16～18 h。取50 mL培養物劃線接種于普通平板，37℃培養16～18 h。待長出單個菌落后，用滅菌牙簽挑取500個菌落，以影印培養法，對應點種于含恩諾沙星藥物不同濃度的平板上和不含藥物的普通平板上，37℃培養24 h，觀察并記錄結果。進行2次重復性試驗。

1.2.2 消除子的篩選與鑒定挑取在含抗菌藥物的選擇平板上不生長，而在不含藥物的普通平板上生長的菌落，在普通培養基上傳代后，再在含藥平板上進行復測后證實，即為質粒消除子，并檢查其菌落、菌形及染色特征[6]。

根據耐藥性消除菌落數與檢測菌落總數之比，計算測試菌耐藥性消除率。將搜集到的消除子與原菌液同時按文獻[7]改進堿裂解法進行快速質粒DNA抽提，瓊脂糖凝膠電泳，以檢測質粒帶的消失情況。將試驗組與對照組所得菌株的耐藥性消除率應用統計軟件SPSS 10.0進行x2檢驗，以比較差異性。

2 結果與分析

1）用復方紫花地丁制劑作用耐藥鴨大腸桿菌24 h、48 h（1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC）后，其消除結果與SDS對照組比較，均有極顯著差異（P<0.01）。表明復方紫花地制劑在體外，具有消除鴨大腸桿菌耐藥質粒的作用，并且消除效果顯著高于SDS對照組。用不同濃度復方紫花地丁制劑作用耐藥鴨大腸桿菌，其消除結果與對照組均有顯著性差異（P< 0.05），表明不同濃度的復方紫花地丁制劑對鴨大腸桿菌耐藥質粒有明顯的影響，在一定濃度范圍內，劑量與功效呈反比。

2）同一濃度復方紫花地丁制劑在不同時間作用耐藥鴨大腸桿菌，其消除結果無顯著性差異（P> 0.05），表明不同作用時間對鴨大腸桿菌耐藥質粒的消除沒有影響（試驗結果見表1-表2）。

表1 不同濃度復方紫花地丁制劑作用24 h對鴨大腸桿菌耐藥質粒的消除率

表2 不同濃度復方紫花地丁制劑作用48 h對鴨大腸桿菌耐藥質粒的消除率

3）消除子質粒的檢測。原始株與消除子經改進堿裂解法快速抽提質粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳觀察發現，消除子均丟失1～2條質粒帶，表明在復方紫花地丁制劑作用下，鴨大腸桿菌菌質粒被消除。結果見圖1-圖2。

圖1 復方紫花地丁制劑作用24 h對鴨大腸桿菌質粒消除的電泳圖譜（M:DNA標準，1:1/2MIC消除菌株，2：1/:4MIC消除菌株，3：1/8MIC消除菌株，4：耐藥菌株）

圖2 復方紫花地丁制劑作用48 h對鴨大腸桿菌質粒消除的電泳圖譜（M:DNA標準，1:1/2MIC消除菌株，2：1/:4MIC消除菌株，3：1/8MIC消除菌株，4：耐藥菌株）

3 討論

1）陳群等用中藥黃芩與止痢靈對重耐藥性大腸桿菌E10株進行了體外R質粒消除試驗，發現與單一中藥比較，聯合用藥可以顯著提高消除效果[7]。本試驗選用的復方紫花地丁制劑為對鴨大腸桿菌制作用的制劑，MIC為120 mg/mL，故選其作為質粒消除劑。結果提示：一定濃度復方紫花地丁液對鴨大腸桿菌的耐藥質粒具有良好的體外消除作用，效果顯著優于SDS。此外，復方紫花地丁液還表現出對多重耐藥性的消除作用。

2）隨著復方紫花地丁制劑濃度的減小，其對耐藥鴨大腸桿菌的耐藥質粒消除率上升，并且有顯著性差異。進行重復性試驗后仍呈現此規律。24 h和48 h的消除率隨時間的延長有所提高，但沒有顯著性差異。表明在一定濃度范圍內，劑量與功效呈反比；作用時間對其質粒消除效果沒有顯著的影響。這與陳群等的結果呈現不一致，可能與中藥抑制試驗尚缺乏統一標準有關。

3）有中藥質粒消除試驗證明，質粒條帶沒有消除的菌株，其抑菌圈仍有擴大。推測可能是因為部分決定耐藥基因被消除，導致堿基數量減少，在凝膠電泳上不能將它們區分。或者制劑作用后菌體內環境發生改變，使一些耐藥片段發生突變，成為“沉默基因”，關于此現象，將在后續試驗中加以證實[8]。

4）中藥制劑雖然一定程度發揮了耐藥消除作用，但作用緩慢。這可能與其有效成分含量低有關。在今后的實踐中，應用現代中藥提取、分析、精制技術，開發抑制細菌耐藥性的純天然高活性抑制劑是比較理想的方向。此外，用于耐藥性消除的中藥本身都具有一定的抗菌效果，其抗菌能力的強弱與逆轉細菌耐藥性之間是否相關還有待進一步研究。

[1]杜銀忠,譚俊.乳源鴨大腸桿菌耐藥基因定位的研究[J].黑龍江畜牧獸醫,2008,9(1):60-62.

[2]李萇清,周歧山,凌保東.耐藥質粒消除的研究概況與展望[J].川北醫學院學報,2003,18(2):168-171.

[3]王靜,張淑文.中藥逆轉細菌耐藥的研究進展[J].臨床和試驗醫學雜志,2007,6(1):153-155.

[4]倪語星,洪秀華.細菌耐藥性監測與抗感染治療[M].北京:人民軍醫出版社,2002.

[5]張文平,曹鎬祿,張文書,等.千里光水浸液對大腸埃希菌R質粒的消除作用[J].廣東醫學,2007,28(8):1238-1239.

[6]劉立新,劉芳萍,李睿,等.中藥消除細菌耐藥性的研究進展[J].畜牧獸醫科技信息,2008,12(5):15-16.

[7]龍海英,劉衡川,方梅.質粒消除方法及消除效果的評價研究[J].中國衛生檢驗雜志,2007,17(3):413-415.

[8]摟愷,班睿,趙學明.細菌質粒的消除[J].微生物學通報, 2002,29(5):99-103.

Mination effcect of complex prescription Herba Violae antibiotic resistant plasmid of duck pathogenic Escherichia coli

Yu Jianguo
(Faculty of Bioengineering,Jinhua Polytechnic,Zhejiang 321007)

The multidrug resistant plasmid from the strain of complex prescription Herba Violae agent,which was isolated from the duck with pathogenic Escherichia coli,was extracted and the elimination test was performed in vitro with sodium dodecyl sulp hate as negative control.The effect of the complex prescription Herba Violae agent prescription dandelion's injection or the plasmid elimination was detected by plasmid DNA extraction and agarose gel electrophoresis,and the feasibility of the complex prescription Herba Violae agent was discussed as elimination reagent.In result,the elimination rate of resistant plasmid of 1/2,1/4 and 1/8 MIC was 6.9%, 8.6%and 10.2%respectively after t reatment of the prescription Herba Violae agent for 24 h.The elimination rate of resistant plasmid of 1/2,1/4 and 1/8 MIC was 7.1%,8.9%and 11.3%respectively at 48 h.These results showed that the elimination effect of t he complex prescription Herba Violae agent was clearly and high feasibility for clinic use.

complex prescription Herba Violae antibiotiresistant plasmid duck pathogenic Escherichia coli elimination

A

1003-4331（2014）06-0032-03