浦城縣乳牛A型口蹄疫免疫效果檢測分析報告

余明興 詹文輝 江松洪 謝榮敏

（1.福建省浦城縣動物疫病預防控制中心 363400；2.福建省南平市動物疫病預防控制中心 353000）

A型口蹄疫是由A型口蹄疫病毒引起偶蹄動物（尤其是豬、牛均可以發生）的急性、熱性、接觸性動物傳染病（目前沒有關于羊發生A型口蹄疫的報道），我國將其列為一類傳染病，一旦發生，對畜牧業將造成巨大的經濟損失，而且嚴重影響人民生活和畜產品貿易。為控制撲滅該病將要耗費大量人力、物力和財力，更嚴重的是，如果該病流行將給畜牧業造成致命影響，間接經濟損失將遠遠超過直接經濟損失。因此，做好該病的預防和控制非常重要，特別是做好該病的免疫預防尤為重要。因為，免疫是預防動物疫病十分重要也是十分必要的有效手段。

1 檢測材料準備

5～50 μL移液器、0.2～10 μL移液器、50～200 μL移液器、50～300μL 12道移液器各一把；移液器槍尖（若干）；96孔一次性抗原抗體反應板；無離子水或蒸餾水；口蹄疫A型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒；規模場乳牛血清40份。

2 操作步驟

1）用包被緩沖液稀釋口蹄疫A型病毒兔抗血清至工作濃度，在酶標板上加50μL孔，振蕩，封板或置濕盒內，室溫過夜。

2）抗原抗體（對照血清及待檢血清）反應：根據不同的需要，選擇圖1-圖2中(試劑盒說明書)的一種布局在抗原抗體反應板上操作，圖1抗體滴度測定（定量）檢測10份樣品布局圖；圖2為抗體滴度測定（定量）檢測20份樣品布局圖。稀釋血清：以圖1為例操作，在96孔血清/病毒抗原反應板上，以50μL孔的量用PBST兩倍連續稀釋被檢血清，從1∶4 至 1∶512。 同時稀釋陽性對照血清， 從 1∶16～1∶2048；稀釋陰性對照血清，從 1∶2～1∶4；將病毒抗原用PBST稀釋至工作濃度，以50μL孔的量加入被檢血清、陰性陽性對照血清至每一稀釋孔內，4孔病毒抗原對照孔僅加入100μL孔稀釋至工作濃度的病毒抗原，振蕩，2～8℃過夜加入等量的病毒抗原后，血清的稀釋度加倍，變為 1∶8～1∶1024。

圖1 96孔酶標板檢測10份樣品布局圖

圖2 96孔酶標板檢測20份樣品布局圖

3）用PBST連續洗酶標板5次，在洗水紙上甩干，再將抗原抗體混合物從抗原抗體反應板上按次序轉移至酶標板上的對應孔，50μL/孔，封板，37℃溫育60 min。

4）同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀釋液將口蹄疫A型病毒豚鼠抗血清稀釋至工作濃度，加50μL孔，封板，37℃溫育60 min。

5）同上洗板5次，甩干。用PBST將兔抗豚鼠ⅠgG-辣根過氧化物酶結合物稀釋至工作濃度，加50 μL/孔，封板，37 ℃溫育 60 min。

6）同上洗板5次，甩干。在洗水紙上甩干，加50μL孔底物溶液 （底物溶液務必要加雙氧水，每1 mL加10μL本試劑盒配備的3%雙氧水），37℃孵育15 min。15 min后每孔再加50μL終止液終止反應，在酶標板上讀取D492nm值。

3 檢測結果判定方法

1）每塊板設病毒抗原對照4孔和陰性陽性血清對照，病毒抗原對照不加任何血清，直接用PBST稀釋至工作濃度，與血清/病毒抗原復合物同步加入酶標板孔，50μL/孔。病毒抗原對照至少2個孔的D492nm值在 1.0～2.0； 陰性對照血清抗體效價應＜1∶8；陽性對照抗體效價應在1∶1024±1個滴度范圍內。

2）以病毒抗原對照平均D492nm值的50%為臨界值，被檢血清D492nm值大于臨界值的孔為陰性孔，小于等于臨界值的孔為陽性孔。某份血清系列稀釋中，陽性孔的最高稀釋倍數為被檢血清的抗體效價，若臨界值處于兩個稀釋孔D492nm值之間，抗體效價取相鄰陽性孔和陰性孔稀釋倍數的對數中間值，如處于1∶64（1og10 的對數值為 1.8）與 1∶128（1og10 的對數值為2.1）之間，則判定該份血清的抗體效價為1∶90（1og10的對數值為 1.95）。

3）抗體效價大于或等于1∶128判為口蹄疫A型抗體陽性；1∶64～1∶128 時，判為可疑；小于或者等于1∶64，判定為陰性。對于可疑血清樣品，可以復測，復測抗體效價大于或等于1∶128，判為陽性，小于1∶128判為陰性。

4 檢測結果

共檢測40份乳牛血清，38份抗體陽性，2份抗體陰性，免疫抗體合格率達95%。

5 結果分析

1）檢測結果表明，浦城縣乳牛A型口蹄疫免疫抗體合格率較高，超過農業部的要求。這與浦城縣采取的一系列防疫措施確保動物免疫質量提升密不可分。一是加大宣傳力度，使乳牛場業主意識到A型口蹄疫的危害性，提高思想認識，自覺做好A型口蹄疫的免疫工作。二是加強督查指導，不定期到乳牛場進行技術指導，督促乳牛場將消毒制度、免疫制度、用藥制度真正落實到位。三是強化疫苗儲運管理，確保疫苗質量。四是規范免疫操作程序，確保免疫效果。

2）造成免疫效果不到位的原因很多。一是疫苗因素：免疫劑量是否正確、接種疫苗毒株與當地流行毒株血清型符合度、疫苗保管是否到位。二是免疫程序和技術人員操作因素。三是飼養管理和畜群健康水平情況的影響。要根據免疫抗體檢測情況，查找問題、分析原因，加大免疫檢測工作力度，掌握浦城縣A型口蹄疫疫情動態，及時提出預警預報。