分泌抗金黃色葡萄球菌細菌素乳酸菌的分離鑒定

王全溪 許麗惠 鄧紅玉 吳雪珍 莊育彬 福建農林大學動物科學學院 福州 350002

分泌抗金黃色葡萄球菌細菌素乳酸菌的分離鑒定

王全溪 許麗惠 鄧紅玉 吳雪珍 莊育彬 福建農林大學動物科學學院 福州 350002

為分離和篩選產抗金黃色葡萄球菌乳酸菌素的優勢乳酸菌，利用乳酸菌分離培養基MRS從收集的各種腌制菜汁中分離培養乳酸菌，通過細菌培養特性、革蘭氏染色特點、生理生化特性初步鑒定，同時根據Genbank中乳酸菌的16S rDNA序列設計特異性引物，采用PCR方法進一步鑒定，并以金黃色葡萄球菌為指示菌對乳酸菌的發酵上清液進行抑菌特性研究。結果表明，從腌漬菜汁中分離獲得90株產酸菌，通過形態學、生理生化特性和PCR鑒定，結果73株產酸菌為乳酸桿菌；分泌產物抑菌試驗表明，有10株菌具有抑制金黃色葡萄球菌活性，經酸排除和過氧化氫排除試驗，仍然有5株乳酸菌的分泌產物具有抑制金黃色葡萄球菌活性。可見，從腌漬菜汁分離到的乳酸菌具有抑制金黃色葡萄球菌活性的特性，主要是通過分泌乳酸菌素來發揮作用。

腌漬菜汁 乳酸菌 乳酸菌素 金黃色葡萄球菌 抑菌性

抗生素作為畜禽抑菌藥物和促生長添加劑在畜牧業生產中得到了廣泛應用。然而長期使用抗生素不但影響動物疾病的防治效果，還會產生抗藥性和殘留，造成嚴重的畜產品污染，有的甚至會誘發人和動物產生癌變和畸變，危及人類的健康與安全，如超級細菌[1]。因此，研制一種能改善畜禽健康、提高生產性能且安全無毒的能替代抗生素的飼料添加劑已成為動物營養研究的一個熱點。

乳酸菌普遍存在于人和動物消化道、發酵食品中的一類兼性厭氧菌。乳酸菌除了利用其產生的有機酸外，現在還發現它可以產生一種具有抑菌或殺菌作用的細菌素（bacteriocin）。20世紀中葉，Jacob[2]建議將細菌所產生的這種代謝物統稱為細菌素，并且根據其產生菌來進行不同細菌素的命名。乳酸菌素是在乳酸菌代謝過程中，合成并分泌到環境中的一類對革蘭氏陽性菌(尤其是親緣性較近的細菌)和革蘭氏陰性菌具有抑制作用的蛋白或多肽，也常稱其為抗菌肽[3]。由于抗生素濫用引起的抗藥性也已經成為一個嚴重的公共健康問題[4]，人們開始熱衷于研究其他可能的抗菌劑。細菌素的治療潛力引起了人們對這一領域的關注。研究者發現lacticin3147有治療金黃色葡萄球菌引起的牛乳房炎的效果[5]。Svetoch等發現鏈球菌S760產生的乳酸菌素對因感染沙門氏菌的雛雞有很好的療效。Christine Beecher（2009）把乳酸菌素Lactococcus lactis DPC 3147注射進乳牛乳房中，結果發現，乳牛乳房中IL-1和IL-8表達大大增加，乳酸菌素具有調動機體免疫應答的能力[6]。可見，乳酸菌素可以起到抑菌并提高機體免疫力的作用。

乳酸菌種類繁多，而各種乳酸菌產生的細菌素各不相同，目前已有40多種，其成分和抗菌譜各不相同。同時，目前對乳酸菌素的研究主要集中在食品行業，而針對畜牧業生產過程中致病菌的乳酸菌素的研究極少。因此，本研究以本實驗室分離的具有高耐藥的致病菌金黃色葡萄球菌作為指示菌，篩選分泌抑制致病性金黃色葡萄球菌乳酸菌素的乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 菌株金黃色葡萄球菌由本實驗室分離鑒定并保存。

1.2 試劑腌漬菜汁：農家自家腌漬菜汁、市銷腌漬菜汁。培養基：改良MRS液體培養基，改良MRS培養基，普通肉湯培養基，普通瓊脂培養基。試劑：革蘭氏染色液配套試劑盒，細菌微量生物反應管（廣東環凱微生物科技有限公司）；PCR擴增試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；DNA Marker（大連寶生物工程有限公司）。

1.3 乳酸菌的分離、鑒定與篩選無菌生理鹽水稀釋收集的各類菜汁，涂布于MRS瓊脂培養基上，37℃厭氧培養48 h，然后挑取單個菌落，進行分離、純化。然后進行菌落形態觀察，革蘭氏染色及顯微觀察，細菌的生理生化試驗。

分子生物學檢測：水煮法提取細菌DNA：根據已發表的相關乳酸菌16S rDNA序列及文獻，選用乳桿菌種群一特異性PCR引物：5′-ATGTGTAGCGGTGAAATGCG-3′和5′-GGCGGCTGGCTCCTAAAAG-3′。預設片段大小為765 bp。PCR反應體系：0.5 μL上引物，0.5 μL下引物，10 μL2×PCR Master，1 μL模板，補足雙蒸水20 μL；擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行37個循環；再72℃延伸7 min。擴增完畢后進行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。最后將PCR擴增產物送由上海生物工程股份有限公司測序，測序結果用NCBI的BLAST工具軟件進行同源性檢索分析。

1.4 乳酸菌上清液對金黃色葡萄球菌的抑菌試驗

1）乳酸菌上清液的制備：將所分離的乳酸菌接種于MRS液體培養基中，活化后取培養液，4℃、11 000 r/min，離心20 min取上清液，備用。

2）金黃色葡萄球菌液的制備：將金黃色葡萄球菌接種于普通肉湯培養基中，37℃培養24 h，活化后將細菌濃度調至1×108cfu/mL，備用。

3）乳酸菌上清液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用：試驗采用牛津杯法。用無菌L棒將金黃色葡萄球菌培養物100 uL均勻涂抹在普通瓊脂培養基上，待干后放置牛津杯。將乳酸菌上清液各200 uL按順序加入牛津杯內（注意做好標記）后，放入4℃冰箱擴散24 h，再放入37℃溫箱培養16 h，觀察有無抑菌環并測量其直徑。

1.5 酸對金黃色葡萄球菌的抑菌作用的排除用無菌L棒將金黃色葡萄球菌培養物100 uL均勻涂抹在普通瓊脂培養基上，待干后放置牛津杯。將調好pH值分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0的改良MRS液體培養基各200 uL按順序加入牛津杯內（注意做好標記）后，放入4℃冰箱擴散24 h，再放入37℃溫箱培養16 h，觀察有無抑菌圈并測量其直徑。

1.6 過氧化氫對金黃色葡萄球菌的抑菌作用的排除為排除過氧化氫對金黃色葡萄球菌抑制作用的影響，將乳酸菌上清液對金黃色葡萄球菌具有抑菌作用的菌株發酵上清液用過氧化氫酶處理，未經處理的發酵上清為對照，金黃色葡萄球菌為指示菌，用牛津杯法驗證上清液的抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的培養特性和革蘭氏染色特性從腌漬菜汁中共分離獲得90株產酸菌，分別進行培養特性、形態染色特性、生化特性和PCR鑒定。結果表明，分離菌菌落形態均為圓形，濕潤，表面光滑且凸起，不透明或半透明，顏色為白色或灰白色，邊緣整齊(見圖1-A)。在培養液中生長物混濁，兼性厭氧。革蘭氏染色，油鏡觀察所分離菌為革蘭氏陽性菌，菌體為短桿狀或球狀，單個、成雙、鏈狀或成堆排列（見圖1-B）。

2.2 菌株的生理生化特性分離菌進行生理生化檢驗,結果表明，接觸酶陰性，不液化明膠，不還原硝酸鹽，不產生吲哚、硫化氫，不分解尿素，MR反應陽性，VP反應陽性；能發酵葡萄糖、蔗糖和乳糖產酸。

圖1 乳酸菌的分離鑒及藥敏試驗[A：MRS培養基菌落特點；B：革蘭氏染色；C：16S的PCR結果（1：乳酸菌陰性；2-5：乳酸菌陽性）；D：乳酸菌上清液抑制金黃色葡萄球菌試驗]

2.3 PCR檢測結果引物設計和PCR反應，1%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1-C。在765 bp有特異的條帶。綜上，初步確定本次試驗共分離到的90株產酸菌中有73株為乳酸菌。

2.4 基因檢測和測序結果分離菌16S rDNA PCR產物送上海生物工程有限公司序列測定。測序結果在NCBI的BLAST進行同源性分析。結果顯示所分離的菌株與NCBI上登記的乳桿酸菌同源性達98%以上，進一步說明所分離菌株為乳桿菌。

2.5 乳酸菌上清液對金黃色葡萄球菌的抑菌試驗牛津杯法抑菌試驗結果表明，73株乳酸菌中有10株乳酸菌上清液對金黃色葡萄球菌有明顯抑菌作用（見表1和圖1-D）。

表1 乳酸菌上清液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

2.6 酸排除試驗結果由于乳酸菌的分泌產物中有一定量的有機酸如乙酸，有機酸對細菌的生長有重要的影響。為此，設計不同pH值來測定酸對金黃色葡萄球菌的影響試驗。由表2可知，不同酸度對金黃色葡萄球菌生長均無影響，特別是酸度達2.0時，仍然不能抑制金黃色葡萄球菌生長。可見，金黃色葡萄球菌具有耐酸的作用。同時也說明乳酸菌培養液對金黃色葡萄球菌的抑制作用并非由于酸的作用。

表2 不同酸度對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

2.7 過氧化氫排除試驗結果過氧化氫是乳酸菌的分泌產物之一，為了證實本次分離的乳酸菌是通過細菌素來抑制金黃色葡萄球菌生長，設計了本試驗。結果見表3，10株分離鑒定的對金黃色葡萄球菌有抑制效果的乳酸菌上清液經過氧化氫酶處理后，其中有5株已失去了抑制作用，說明這些菌株與其分泌的過氧化氫有關，而還有5株分離菌其抑菌圈直徑和原上清液的抑菌圈直徑相比變化不大，說明這5株乳酸菌是通過其分泌產物如細菌素來抑制金黃色葡萄球菌的生長。

表3 過氧化氫排除試驗的影響

2.8 乳酸菌的測序鑒定結果本試驗將5株經酸排除和過氧化氫排除試驗后仍然對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制效果的乳酸菌進行測序，經基因遺傳進化樹分析表明，該5株分離菌均為植物乳桿菌。

3 討論

1）乳酸菌種類繁多，而各種乳酸菌產生的細菌素各不相同。本次試驗通過從農家自制各種腌制的咸菜中分離并鑒定了73株乳酸菌，經過酸排除試驗和過氧化氫試驗，最終確定5株乳酸菌其主要通過細菌素來抑制金黃色葡萄球菌的生長，測序分析表明，該5株菌為植物乳桿菌。

2）每種乳酸菌至少應該能夠分泌一種乳酸菌素，甚至一種乳酸菌可能產生幾種乳酸菌素[7]。我國擁有豐富的乳酸菌資源庫，但是如何在如此豐富復雜的乳酸菌資源庫中快速有效地篩選出廣譜高效的乳酸菌素高產菌株，這是面臨的一個重要的難題[8]。建立高通量篩選模型是新型乳酸菌開發的重要方法之一。易華西建立了Colony-PCR高能量篩選方法，從275株乳酸菌中獲得1株Class 2a抗菌肽產生菌株[9]。本次試驗沒能應用高能量篩選方法，所以在篩選過程耗費了大量的人力和時間，在今后的試驗中應該改進試驗方法，提高篩選效率。

3）乳酸菌素是由乳酸菌分泌的一種具有殺菌功能的多肽或蛋白質，它對腐敗菌和致病菌都有一定的抑制作用，但是細菌素本身卻被消化道中的酶降解，所以現在普遍認為乳酸菌素是一種無毒安全的食品添加劑[8]。因此，篩選廣譜抗菌功能乳酸菌素是未來的趨勢。本次試驗分離的乳酸菌，通過酸排除和過氧化氫排除試驗，基本能夠確定，其抑菌物質是乳酸菌素，然而該細菌素是否具有廣譜抑菌功能，將在后續試驗中進一步探討。同時，如何更好地把乳酸菌素應用于畜牧生產中也是廣大畜牧工作者的一個重要的研究方向。因為，抗生素的弊端在畜牧生產中已經不斷體現出來，如細菌的高度耐藥、抗生素殘留對人體健康的影響等。健康養殖、食品安全仍然是當前畜牧生產中的一大難題。

4）在細菌素的研究中仍存在許多問題，主要體現在：細菌素的產量較低、細菌素的抑菌譜較窄、細菌素在不同介質中的溶解性和穩定性較差。因此，在今后一段時間，乳酸菌素的研究重點是根據已知蛋白質結構設計全新的氨基酸序列，人工合成新型細菌素或對現有的細菌素進行改造,提高乳酸菌細菌素的應用潛力，利用DNA重組技術合成滿足人們要求的活性多肽或蛋白質，提高乳酸菌素產量水平，拓寬乳酸菌素抑菌譜，提高乳酸菌素穩定性，提高乳酸菌素抑菌活力，探討細菌素產生菌株的自身免疫性機制[10]。

[1]朱蓓蕾.動物性食品藥物殘留[M].上海:上海科學技術出版社,1994.

[2]Jacob F,Siminovitchl,Wollmane.Biosynthesis of a colicin and its mode of action[J].Ann Inst Pasteur(Paris),1952,83(3): 295-315.

[3]還連棟,賈士芳,莊增輝,等.乳鏈菌肽(NISIN)的殺菌作用機制[J].中國食品添加劑,1997(4):21-22.

[4]唐忠有.應用乳酸菌素與抗生素類藥物預防畜禽腸道細菌性疾病的分析[J].現代畜牧獸醫,2008(3):45.

[5]Clare Piper,Pat G.Casey,Colin Hill,et al.The Lantibiotic lacticin 3147 prevents systemic spread of staphylococcus aureus in a murine infection model[J].International Journal of Microbiology,2012:1-6.

[6]Christine Beecher,Mairéad Daly,Donagh P Berry,et al.Administration of a live culture of Lactococcus lactis DPC 3147 into the bovine mammary gland stimulates the local host immune response,particularly IL-1 beta and IL-8 gene expression[J].Journal of Dairy Research,2009,76:340-348.

[7]蔣志國,杜琪珍.乳酸菌素研究進展[J].中國釀造,2008(18): 1-4.

[8]牟光慶,李霞,李慧,等.廣譜乳酸菌素的研究[J].食品科學, 2008,29(11):469-472.

[9]易華西.分泌廣譜抗菌肽乳酸菌的篩選及高效表達的調控研究[D].哈爾濱:哈爾濱工業大學,2010:1-2.

[10]陳靜,張玉蒼,何連芳.乳酸菌產細菌素的研究進展及其應用前景[J].安徽農業科學,2011,39(4):1925-1927.

Isolation and identification of lactic acid bacteria producing anti-Staphylococcus aureus bacteriocin

Wang Quanxi Xu Lihui Deng Hongyu Wu Xuezhen Zhuang Yubin
(College of Animal Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002)

The study was carried out to separate the lactic acid bacteria which could produce the bacteriocin against S.aureus.In this experiment,the lactic acid bacteria were isolated from the salted and preserved vegetables with the MRS medium.Identification was done by bacterial culture characteristics,Gram stain characteristics,physiological and biochemical characterization,And the bacteria was identified by PCR.The antibacterial properties of lactic acid bacteria fermentation supernatant was studied.The results showed that 73 strains acid-producing bacteria were isolated,and were identified to Lactobacillus by morphological characteristics,biochemical characteristics and PCR.The antibacterial test showed that there were ten strains Lactobacillus which secretory products could inhibit staphylococcus aureus.Ruled out by acid and hydrogen peroxide exclusion experiments,there were still 5 strains of lactic acid bacteria which secretion can inhibit staphylococcus aureus.Therefore,in this experiment the lactic acid bacterium that isolated from the salted and preserved vegetables have the activity of anti-Staphylococcus aureus,which is mainly through the secretion of lactic acid bacteria.

Pickled vegetable juice Lactic acid bacteria lactobacillus Staphylococcus aureus antimicrobial activity

A

1003-4331（2014）06-0009-04

福建省教育廳科技項目B類（JB12054）資助。