肺腺癌胸腔積液上清液和細胞塊EGFR基因突變檢測的臨床意義

孟加榕，潘羨心，郭以河，溫路生，劉美蓮，禹 樂，戴太監

分子靶向藥物表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI)在肺腺癌患者的治療中已得到廣泛的認可和應用［1-7］。研究證實EGFR-TKI與表皮生長因子受體(EGFR)的激活突變有關。因此患者在使用TKI藥物前需進行EGFR基因突變檢測［1，2，8-10］。許多晚期肺腺癌患者因為失去了手術機會而難以獲得組織標本，而胸腔積液是晚期該類患者常見的并發癥之一，且此標本較容易獲取。已有研究證實高分辨率熔解曲線(high-resolution melting，HRM)是較準確、敏感、快速且可用于臨床的基因突變檢測方法［11-13］。筆者前期已應用HRM方法對肺腺癌患者胸腔積液上清液、細胞塊EGFR基因突變的臨床意義進行了探討［14-15］。關于肺腺癌胸腔積液細胞塊及上清液成分進行EGFR基因突變檢測的比較尚未見報道。本文旨在應用HRM方法比較這兩種惡性胸腔積液成分EGFR基因突變狀態，為尋找有效的胸腔積液成分進行高效快速EGFR基因突變檢測提供實驗依據，更好地為臨床服務。

1 材料與方法

1.1 材料 收集解放軍175醫院2010年9月—2013年5月臨床送檢胸腔積液標本43例，細胞學涂片中均檢到癌細胞，胸腔積液細胞塊經HE染色和免疫組化確診為肺腺癌，限定癌細胞量占細胞總量5%以上的樣本為合格樣本，用于后續實驗。43例中男21例，女22例;不吸煙患者32例，曾經吸煙和目前仍吸煙患者11例;臨床分期均為Ⅲ～Ⅳ期，均未接受過TKI類藥物治療。

1.2 試劑胸腔積液上清液DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，美國QIAGEN公司);石蠟包埋組織DNA提取試劑盒(QIAamp DNA FFPE Tissue kit，美國QIAGEN公司);EGFR基因突變檢測試劑盒(廣州好芝生物科技有限公司)。

1.3 儀器 Light Cycle 480II實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司);熒光凝膠成像分析系統(美國UVP公司);Amoydx-Giraffe紫外分光光度計SMA4000(廈門艾德生物醫藥科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 胸腔積液上清液制備方法:臨床送檢的新鮮胸腔積液標本，取約12 ml置入15 ml離心管中，2000 r/min，離心5 min，收集上清液。

1.4.2 胸腔積液細胞塊制備方法:①臨床送檢新鮮胸腔積液，用15 ml尖底離心管取約12 ml胸腔積液，2000 r/min，離心5 min，棄上清，如細胞量過少，可重復離心，棄上清;②加入4%中性甲醛6 ml，震蕩混勻;③靜置 30 min左右，2000 r/min，離心5 min，棄上清;④用吸管將離心管底部的沉淀吸取至顯微鏡擦鏡紙上，包好，置入4%中性甲醛中固定，后經組織脫水浸蠟，制成石蠟細胞塊。

1.4.3 DNA提取和定量分析:選擇經HE染色和免疫組化確診為肺腺癌且癌細胞量占細胞總量5%以上的病例，試劑盒法分別提取其上清液和細胞塊DNA。將提取好的DNA樣本通過紫外分光光度計測定DNA濃度和純度，將DNA濃度稀釋至4 ng/μl，濃度低于4 ng/μl的樣品直接取原液進行實驗。

1.4.4 引物設計:采用引物設計軟件(primer premier 5．0)設計外顯子 18-21引物，并使用 Primer-BLAST軟件分析其特異性，確定熔解溫度。如表1所示，所有擴增片段均＜250 bp，符合HRM小片段的要求。

表1 HRM-PCR引物序列

1.4.5 HRM法分析:應用基于HRM-PCR技術的EGFR基因突變檢測試劑盒，對胸腔積液上清液DNA和細胞塊 DNA EGFR 基因第18、19、20、21外顯子分別進行突變檢測。HRM-PCR反應體系為10 μl，樣本 DNA(濃度 4 ng/μl)取 5 μl，檢測反應液 3．9 μl，熒光染料 1 μl，DNA 聚合酶 0．1 μl，每個外顯子分別設野生對照和突變對照。配置好后，在LC480上按照如下反應條件進行HRM檢測及結果分析。第一階段(酶激活階段):95℃、5 min;第二階段(PCR 擴增階段):95℃、30 s，65℃、30 s(檢測熒光)，50個循環;第三階段(熔解階段):95℃、30 s，40℃、30 s，70 ～ 90℃ (0．03℃ /s、連續熒光采集);第四階段(冷卻階段):4℃。

1.5 統計學方法 采用SPSS 15．0分析軟件進行數據分析，應用χ2檢驗比較HRM方法檢測胸腔積液上清液和細胞塊EGFR第18、19、20、21外顯子突變率差異，α=0．05為檢驗水準。

2 結果

2.1 胸腔積液上清液和細胞塊EGFR基因突變率比較 HRM方法檢測上清液EGFR基因總突變率為39．53%(17/43)，細胞塊EGFR基因總突變率為34．88%(15/43)。兩種胸腔積液成分HRM方法檢測突變率差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 胸腔積液上清液和細胞塊EGFR基因突變位點分布 胸腔積液上清液和細胞塊EGFR基因突變位點分布一致，均為第19、21外顯子突變，如圖1。上清液EGFR基因第19外顯子突變14例，第21外顯子突變3例;細胞塊EGFR基因第19外顯子突變12例，第21外顯子突變3例。胸腔積液細胞塊EGFR第21外顯子基因突變與上清液完全一致，為3例相同患者，如圖2A。胸腔積液上清液EGFR第19外顯子基因突變陽性而細胞塊陰性的病例3例，如圖2B。上清液EGFR第19外顯子突變陰性細胞塊檢測陽性的病例1例，如圖2C。

圖1 肺腺癌胸腔積液上清液和細胞塊表皮生長因子受體基因突變高分辨率熔解曲線圖

圖2 3例肺腺癌胸腔積液細胞塊(HE×200)

3 討論

筆者前期對收集的43例肺腺癌胸腔積液上清液和細胞塊分別進行了EGFR基因突變檢測，結果表明HRM方法和基因測序法檢測突變率差異均無統計學意義，HRM方法檢測靈敏度優于測序［14-15］。靈敏的基因檢測方法可以提高胸腔積液EGFR基因突變檢出率，可使更多的患者受益于EGFR-TKI藥物的治療。本文主要探討應用HRM方法檢測同一肺腺癌患者胸腔積液上清液和細胞塊EGFR基因突變狀態，為尋找有效的胸腔積液成分進行高效快速EGFR基因突變檢測提供實驗依據。

應用HRM法檢測肺腺癌患者胸腔積液上清液和細胞塊標本，兩者突變率差異無統計學意義。EGFR基因突變類型一致，均為第19、21外顯子突變。胸腔積液細胞塊EGFR第21外顯子基因突變的結果與上清液完全一致，為相同患者。胸腔積液上清液EGFR第19外顯子基因突變檢測陽性而細胞塊檢測陰性的病例有3例，分析發現該3例患者均為女性，已屬肺腺癌Ⅳ期，胸腔積液中炎性細胞、間皮細胞、紅細胞所占比例較大(最低達到80%)。上清液存在變性腫瘤細胞核碎片和DNA片段，成分較單一，干擾因素較少，且易于操作，重復性較好，胸腔積液離心后炎性細胞和間皮細胞處于中間層，紅細胞處于最底層，兩者對上清液結果影響不大，但經甲醛固定、石蠟包埋后，過多的野生型DNA對細胞塊結果可能造成干擾，從而造成細胞塊EGFR結果假陰性。但上清液癌細胞數量不固定，有時癌細胞DNA含量較少，也易造成假陰性，這種情況下宜選取細胞塊進行檢測。而上清液EGFR第19外顯子突變檢測陰性而細胞塊檢測陽性的病例有1例，為男性患者，實驗過程中發現該患者送檢胸腔積液腫瘤細胞含量很少，離心多次才富集而得細胞塊。上清液可能由于腫瘤DNA片段含量過少導致假陰性。

但胸腔積液細胞塊成分大部分為炎細胞、間皮細胞和紅細胞，干擾因素多，這些細胞所占比例較大的情況下檢測結果可能存在假陰性，故應考慮上清液進行EGFR基因突變檢測，簡單快速。考慮存在假陰性的可能和腫瘤異質性［16-20］，建議EGFR檢測前兼顧細胞學及HE結果，對腫瘤細胞含量和炎性細胞、間皮細胞、紅細胞等比例進行評估，炎性細胞、間皮細胞、紅細胞等所占比例較大，腫瘤細胞含量較多的情況下宜選取上清液進行檢測，腫瘤細胞含量較少，炎性細胞、間皮細胞、紅細胞等所占比例較少時宜富集細胞塊進行突變檢測，臨界條件兩種成分兼顧，以保證結果的可靠性。因本研究用于兩種成分比較的樣品數仍較少，故后期將增加樣品數以獲得臨界條件的準確值。

綜上所述，肺腺癌胸腔積液上清液和細胞塊可用于檢測其EGFR基因突變狀態，但由于存在假陰性可能以及腫瘤異質性，建議EGFR檢測前兼顧細胞學及HE結果，對腫瘤細胞含量和炎性細胞、間皮細胞、紅細胞等比例評估，以保證結果的可靠性。

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