乙肝病毒DNA定量水平和乙型肝炎病毒標(biāo)志物定量檢測指標(biāo)相關(guān)性研究

楊 勇，王占科，陳 鑫，鐘 瑩

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)標(biāo)志物是HBV顆粒外殼蛋白成分誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的抗體，結(jié)果異常并不意味著外周血存在HBV完整顆粒［1-4］。通過檢測HBV DNA可以了解HBV在體內(nèi)存在的數(shù)量，HBV是否復(fù)制，乙型肝炎是否具有傳染性及傳染性有多強，是否有必要服藥，確定肝功能改變是否是由病毒引起，判斷適合用哪類抗病毒藥物及藥物治療的效果［5-8］。因此，HBV DNA定量檢測在臨床上意義重大。HBV標(biāo)志物定性檢測與HBV DNA定量檢測的相關(guān)性研究，國內(nèi)外已有報道［9-12］，但HBV標(biāo)志物定量檢測與HBV DNA定量檢測的相關(guān)性研究，國內(nèi)報道不多，為此，我們以大三陽和小三陽患者作為研究對象，同時檢測其HBV標(biāo)志物定量結(jié)果和HBV DNA定量結(jié)果，并進行統(tǒng)計學(xué)分析和比較，旨在探討HBV標(biāo)志物定量檢測和HBV DNA定量檢測在判斷HBV感染者傳染性中的臨床意義，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2013年1月1日—2014年6月1日來我院檢驗科采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)確診的在感染性疾病科門診就診和住院的大三陽368例和小三陽507例中，各隨機選取50例作為大三陽組和小三陽組。大三陽組外周血HBV標(biāo)志物HBsAg陽性、HBeAg陽性和HBcAb陽性，小三陽組組外周血HBsAg陽性、HBeAb陽性和HBcAb陽性。大三陽組男女性別比為 1:0．45，年齡(40．32±12.36)歲;小三陽組男女性別比為1:0．51，年齡(42．80±12．36)歲，大三陽組和小三陽組性別構(gòu)成比、年齡之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 材料與方法 大三陽組和小三陽組的血標(biāo)本同時做HBV標(biāo)志物定量和HBV DNA定量檢測。外周血HBV標(biāo)志物定量檢測采用時間分辨熒光免疫測定法(TRFIA)測定，ELISA定性檢測HBV標(biāo)志物試劑盒從北京萬泰生物技術(shù)有限公司購買，在上海普朗酶標(biāo)儀上進行測定，實驗操作和結(jié)果判讀參考試劑盒操作說明書進行，陽性對照檢測結(jié)果陽性，陰性對照檢測結(jié)果陰性，室內(nèi)質(zhì)量控制在控。外周血HBV DNA定量檢測采用實時熒光定量PCR技術(shù)進行測定，試劑盒及實時熒光定量PCR擴增儀從廈門安普利生物技術(shù)有限公司購買，并保證室內(nèi)質(zhì)量控制結(jié)果在控，我院檢驗科基因擴增PCR實驗室通過省衛(wèi)生廳驗收合格。

1.3 結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) HBV標(biāo)志物定量檢測結(jié)果≥正常參考范圍上限為陽性，用實際數(shù)值表示;HBsAg結(jié)果超過240 ng/ml，需對檢測標(biāo)本進行倍比稀釋后進行檢測，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，檢測結(jié)果低于正常參考范圍下限為陰性。HBV DNA定量檢測結(jié)果用每毫升樣本的DNA拷貝數(shù)(copies/ml)表示，≤500為陰性。實時熒光定量PCR以起始HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，根據(jù)待測樣品的Ct值計算待測樣品的HBV DNA的拷貝數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 檢測到的陰性或陽性結(jié)果用百分率表示，采用卡方檢驗。檢測到的計量數(shù)據(jù)，先通過正態(tài)分布性檢驗，如果數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，如果數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布需進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后呈正態(tài)分布，再用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，HBV DNA定量檢測結(jié)果數(shù)據(jù)需要進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，采用t檢驗。相關(guān)性分析應(yīng)用相關(guān)系數(shù)顯著性分析。α=0．05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 大三陽組和小三陽組HBV標(biāo)志物定量和HBV DNA定量檢測結(jié)果分析 大三陽組定量檢測HBsAb和 HBeAb均為陰性;小三陽組定量檢測HbeAg均為陰性;大三陽組 HBsAg含量和 HBV DNA定量檢測結(jié)果均明顯高于小三陽組(P＜0.01)，HBcAb與小三陽組比較，無顯著性差異(P＞0．05)，見表1。

表1 2組乙型肝炎患者乙型肝炎病毒標(biāo)志物和乙肝病毒DNA定量檢測結(jié)果比較(±s)

表1 2組乙型肝炎患者乙型肝炎病毒標(biāo)志物和乙肝病毒DNA定量檢測結(jié)果比較(±s)

注:b P＜0.01

項目 單位 大三陽組(n=50)小三陽組(n=50)HBsAg ng/ml 165．23 ±86．14 42．18 ±16．77b HBsAb mIU/ml 陰性(＜10．0) 陰性(＜10．0)HBeAg PEIU/ml 26．56 ±12．14 陰性(＜0．5)HBeAb PEIU/ml 陰性(＜0．2) 3．02 ±0．81 HBcAb PEIU/ml 3．36 ±0．60 3．17 ±0．82 HBV DNA Lg(copies/ml) 7．32 ±1．30 4．35 ±2．11b

2.2 大三陽組和小三陽組HBV DNA定量陽性率比較 大三陽組HBV DNA定量陽性率為96．00%(48/50)，小三陽組陽性率為 16．00%(8/50)，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 HBV DNA陽性的大三陽患者HBV DNA含量與HBeAg含量相關(guān)性研究 48例HBV DNA陽性的大三陽患者HBV DNA含量與HBsAg相關(guān)系數(shù)為0．6832，與 HBeAg 含量相關(guān)系數(shù)為 0．8563，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

HBV感染呈世界性流行，但不同地區(qū)HBV感染的流行強度差異很大，傳播途徑不確定［13-16］。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3．5億人為慢性HBV感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌［17-20］。HBV感染者部分發(fā)展成肝炎，部分為正常攜帶者，也有部分發(fā)展成肝硬化和肝癌［21-23］。HBV感染率高，不僅危害社會公共健康，也是醫(yī)務(wù)人員職業(yè)暴露時容易感染的病毒［24-25］，HBV感染者一部分人群為正常人群，無傳染性，也有部分人群具有傳染性，判斷HBV感染者是否具有傳染性，對做好HBV感染控制和預(yù)防工作，具有重要意義［26-29］。

HBV是一種具有嗜肝細(xì)胞生物學(xué)特征的雙鏈DNA病毒，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。HBV含4個部分重疊的開放讀碼框(ORF)，即前S/S區(qū)、前C/C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。前S/S區(qū)編碼大(前S1、前S2及S)、中(前S2及S)、小(S)3種包膜蛋白;前C/C區(qū)編碼HBeAg及HBcAg;P區(qū)編碼聚合酶;X區(qū)編碼X蛋白。HBV基因組長度為3．2 kb，病毒完整顆粒為42 nm，包括病毒顆粒外殼和內(nèi)核兩部分，1965年由Dane發(fā)現(xiàn)，又稱丹妮顆粒［30］。HBV主要存在于患者肝細(xì)胞內(nèi)，如果HBV不復(fù)制或不活動，完整的病毒顆粒一般不會通過肝細(xì)胞膜釋放或分泌到肝細(xì)胞外，只分泌一些HBV外殼中的部分抗原物質(zhì)，如HBV表面抗原等。肝臟是一個血供極其豐富的器官，一旦HBV從肝細(xì)胞內(nèi)溢出，完整的含有病毒DNA的 HBV顆粒就存在于血液中［31］。外周血HBV存在3種形式，一是直徑為22 nm的球形顆粒，無傳染性，一般為 HBsAg蛋白;二是直徑為22 nm，長度為100 nm以上的管狀顆粒，也主要由HBsAg組成，不含核酸，無傳染性;三是大球形顆粒，也就是完整的HBV顆粒，直徑約42 nm，分為包膜和核心兩部分。包膜含HBsAg、HbeAg等抗原，核心含HBcAg抗原、環(huán)狀雙股HBV DNA和HBV DNA多聚酶，具有傳染性。因此，判斷HBV感染者是否具有傳染性主要取決于外周血有沒有完整的HBVDNA 和 HBeAg。

檢測HBV標(biāo)志物的方法有很多，ELISA是檢測HBV標(biāo)志物的經(jīng)典方法，但只能定性，定量比較困難，不能確定患者血液中HBV相關(guān)抗原和抗體的含量，這對觀察HBsAg的含量變化、判斷臨床治療效果造成困難。TRFIA是一種繼放射免疫、酶免疫和發(fā)光免疫后的一種非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)。鑭系元素的螯合物為TRFIA所使用標(biāo)記物，具有發(fā)出的熒光時間長、強度高等特點，因為大部分背景非特異熒光都是短暫存在的短時間熒光，鑭系金屬螯合物發(fā)出的熒光時間長，可有效地避免本底非特異熒光的干擾，故稱TRFIA［32］。TRFIA是一種定量檢測HBV標(biāo)志物的新方法，具有靈敏度高、特異性好等特點［33］。本實驗表明:ELISA證實的大三陽和小三陽患者經(jīng)TRFIA方法檢測均證實為大三陽和小三陽患者，提示HBV定量檢測和定性檢測結(jié)果一致。定性檢測向定量檢測發(fā)展是檢驗技術(shù)創(chuàng)新的方向，實時熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR技術(shù)為準(zhǔn)確定量檢測外周血中HBV顆粒DNA水平，提供實驗工具［34］。

本研究結(jié)果表明:大三陽患者HBV表面抗原含量明顯高于小三陽患者，提示大三陽患者體內(nèi)病毒含量較多，進一步研究證明，大三陽患者HBV DNA含量也明顯高于小三陽患者，為判斷大三陽患者具有較強的傳染性提供直接實驗室證據(jù)。同時，研究結(jié)果也表明:大三陽患者HBV DNA陽性率明顯高于小三陽患者，但并不是所有的小三陽患者HBV DNA都是陰性，也不是全部大三陽患者HBV DNA都是陽性，提示并不是全部小三陽患者都沒有傳染性，也不是全部大三陽患者都具有傳染性。判斷HBV感染者是否具備傳染性，必須結(jié)合PCR的方法檢測HBV DNA。當(dāng)外周血存在完整的包裹DNA的病毒顆粒時，PCR才能檢測出陽性結(jié)果。HBV完整顆粒從肝細(xì)胞內(nèi)分泌到外周血，是HBV正在復(fù)制的標(biāo)記，HBV在復(fù)制過程中，高表達HBeAg到血液中，這可能是我們發(fā)現(xiàn)的HBV DNA含量和HBeAg明顯正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)大于其和HBsAg相關(guān)系數(shù)的原因。

［1］ 胡建平．不同加樣方式對酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測抗－HBc的影響［J］．臨床誤診誤治，2011，24(6):81．

［2］ 趙莉平，安榮，李彥魁，等．常規(guī)易測檢驗指標(biāo)與慢性乙肝中醫(yī)證型相關(guān)性研究［J］．中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，10(16):118-120．

［3］ 張紅娟，崔辰瑩，張潔．乙肝病毒外膜大蛋白檢測及其對判定 HBV DNA復(fù)制的意義［J］．武警醫(yī)學(xué)，2011，22(11):943-945．

［4］ 魏平，陳繼德．2462份血清乙型肝炎標(biāo)志物檢測結(jié)果分析［J］．華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2011，25(6):498-499，517．

［5］ 劉義慶，欒芳，趙躍然．乙型肝炎病毒感染與肝外細(xì)胞及自身免疫病的研究進展［J］．中國醫(yī)藥，2013，8(10):1515-1516．

［6］ 歐曉娟，王曉明，尤紅，等．阿德福韋酯(阿迪仙)治療慢性乙型肝炎患者4年臨床療效觀察［J］．首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，31(5):570-572．

［7］ 劉阿敏，朱斌，李旭英．慢性乙型肝炎干擾素抗病毒治療的心理護理［J］．中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2009，12(9):1446-1447．

［8］ 張業(yè)霞，金玉懷．乙肝病毒抗原抗體與HBV－DNA的臨床研究［J］．中國現(xiàn)代醫(yī)生，2014，52(6):48-50，53．

［9］ 張蓓，楊曉云，劉蕊，等．熒光定量PCR檢測HBV-DNA與乙肝兩對半檢測結(jié)果的相關(guān)性探討［J］．河北醫(yī)學(xué)，2006，12(9):835-838．

［10］ Loriot M A，Marcellin P，Bismuth E，et al．Demonstration of hepatitis B virus DNA by polymerase chain reaction in the serum and the liver after spontaneous or thera-peutically induced HBeAg to anti-HBe or HBsAg to anti-HBs seroconversion in patients with chronic hepatitis B［J］．Hepatology，1992，15(1):32-36．

［11］何菊芳，佟愛華，楊彩娥．HBV感染的兩種血清學(xué)模式患者肝損傷及體液免疫水平的比較［J］．武警醫(yī)學(xué)，2011，22(10):862-864．

［12］杜輝，劉京輝．探討乙型肝炎病毒前S1抗原和乙型肝炎病毒DNA的相關(guān)性及臨床意義［J］．臨床誤診誤治，2010，23(8):705．

［13］陳欽艷，方鐘燎，楊益超，等．廣西乙型肝炎病毒感染及肝功能情況調(diào)查［J］．廣西醫(yī)學(xué)，2013，35(11):1432-1434，1438．

［14］ Martinot-Peignoux M，Marcellin P，Asselah T．Hepatitis B:clinical application of HBsAg quantification［J］．Ann Biol Clin，2013，71:19-26．

［15］楊富強，王平，朱磊．乙型肝炎患者檢測血清前白蛋白及α1－抗胰蛋白酶含量的意義［J］．臨床誤診誤治，2009，22(12):52．

［16］李愛輝，常晉玲．慢性乙型肝炎患者的心理障礙及護理對策［J］．中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2010，13(3):467．

［17］ Burdino E，Ruggiero T，Proietti A，et al．Quantification of hepatitis B surface antigen with the novel DiaSorin LIAISON XL Murex HBsAg Quant:Correlation with the ARCHITECT quantitative assays［J］．J Clin Virol，2014，60(4):341-346．

［18］ Woo SM，Park J W，Lee W J，et al．Clinical and virological responses to clevudine therapy of hepatocelluar carcinoma patients with chronic hepatitis B［J］．Gut Liver，2011，5(1):82-87．

［19］李青峰，畢雷，尚鵬程，等．Pre-S1、S2抗原檢測在乙型肝炎臨床診斷中的作用及價值［J］．中國醫(yī)藥科學(xué)，2013，3(14):119-120．

［20］諸葛璐，金玲湘，林巍．輕度慢性乙型肝炎患者肝組織中HBcAg及TGF-β1的表達及臨床意義［J］．中國現(xiàn)代醫(yī)生，2011，49(26):17-19．

［21］黃金鳳．乙型肝炎病毒X蛋白相關(guān)原發(fā)性肝癌發(fā)生中的表觀遺傳學(xué)機制研究［D］．第二軍醫(yī)大學(xué)，2012．

［22］ Assar S，Arababadi M K，Ahmadabadi B N，et al．Occult hepatitis B virus(HBV)infection:a global challenge for medicine［J］．Clin Lab，2012，58(11-12):1225-1230．

［23］Lin C L，Kao J H．Hepatitis B viral factors and clinical outcomes of chronic hepatitis B［J］．JBiomed Sci，2008，15(2):137-145．

［24］周斌，王效雷，李宗香，等．乙型肝炎病毒經(jīng)手術(shù)傳播感染閾值的實驗研究［J］．解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2013，31(5):411-413．

［25］羅獻偉，王建軍．安徽省2006年1－59歲人群乙型病毒性肝炎感染狀況的血清流行病學(xué)調(diào)查［J］．中華疾病控制雜志，2013，17(2):156-159．

［26］ Chen G Y，Zhu M F，Zheng D L，et al．Baseline HBsAg predicts response to pegylated interferon-α2b in HBeAgpositive chronic hepatitis B patients［J］．World J Gastroenterol，2014，20(25):8195-8200．

［27］Poljak M，Lepej SZ，Rode OD．Recent developments in serologic and molecular diagnosis of hepatitis B and C［J］．Acta Med Croatica，2013，67(4):281-290．

［28］黃靜．熒光定量PCR檢測HBV－DNA與ELISA法乙肝免疫學(xué)檢測的探討［J］．中國醫(yī)藥科學(xué)，2013，3(6):110-111，123．

［29］何冰，曹茜，曹武奎，等．應(yīng)用 SELDI－TOF－MS技術(shù)分析慢性乙肝患者血清差異表達蛋白［J］．武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，16(3):225-227．

［30］楊軍，秦波．乙肝病毒基因型的研究進展［J］．西南國防醫(yī)藥，2011，21(3):338-340．

［31］李華東，江建寧，陸暉，等．慢性乙型肝炎病毒感染者肝細(xì)胞HBV cccDNA含量與血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg的關(guān)系研究［J］．中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2012，26(6):499．

［32］ Hu Z，Li M，Huang B，et al．Detection of hepatitis B virus PreS1 antigen using a time-resolved fluoroimmunoassay［J］．JImmunoassay Immunochem，2012，33(2):156-165．

［33］馬興璇，劉春明，王林春．時間分辨熒光免疫分析法定量檢測845例乙型肝炎標(biāo)記物結(jié)果分析［J］．檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2013，10(4):441-442．

［34］何紫琪，李從榮，童永清．乙型肝炎病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立［J］．國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2014，35(4):464-466．