β-Catenin和Wnt5a蛋白在人牙齒早期發育過程中的表達

王冰梅，劉 英，林 鑫，唐 玲，曾金鎮，柳志堅

（福建師范大學生命科學學院；福建省發育與神經生物學重點實驗，福建福州350108）

β-Catenin和Wnt5a蛋白在人牙齒早期發育過程中的表達

王冰梅，劉 英，林 鑫，唐 玲，曾金鎮，柳志堅

（福建師范大學生命科學學院；福建省發育與神經生物學重點實驗，福建福州350108）

以人牙胚為材料，運用免疫組織化學染色技術分別檢測經典Wnt信號通路的β-Catenin和非經典Wnt信號通路的Wnt5a的表達模式.結果表明：從12 W人牙胚帽狀期到15 W鐘狀期，β-Catenin蛋白在牙上皮細胞的表達強于牙間充質細胞，且其在磨牙細胞的表達強于門牙；隨著發育的成熟，β-Catenin蛋白在內釉上皮細胞的表達增強，而在外釉上皮層和星網狀層的表達降低.Wnt5a蛋白在人牙胚中的牙間充質細胞的表達強于牙上皮；從帽狀期到鐘狀期，Wnt5a蛋白在內釉上皮層和星網狀層的表達降低，β-Catenin蛋白的表達整體明顯高于Wnt5a.因此，經典Wnt信號通路在人牙齒早期發育過程中發揮重要的作用.

β-Catenin；Wnt5a；人牙胚；表達模式

牙齒的形成和發育是牙源性上皮和神經嵴來源的間充質之間相互作用的復雜過程［1］.牙齒的發育過程受到許多信號通路的調控，這些信號因子包括骨形態發生蛋白（Bone morphogenetic protein,BMP）、成纖維生長因子（Fibroblast growth factors，FGF）、刺猬蛋白（Sonic hedgehog,SHH）和Wnt（Wingless-type MMTV integration site）因子等四個主要信號家族［2］.其中Wnt信號家族調控的信號轉導系統稱為Wnt信號通路.Wnt信號通路被分為兩類：依賴于β-Catenin的經典Wnt信號通路和不依賴于β-Catenin的非經典Wnt信號通路.非經典Wnt信號通路主要有兩類：Wnt/Ca2+通路和Wnt/PCP通路［3-9］.

然而，有關Wnt信號通路在牙齒發育過程中的研究一般都是以模式動物小鼠為研究對象，對其在人類牙齒發育過程中的作用研究甚少.顯然，非人類的脊椎動物牙齒發育過程中所存在的信號通路與人類牙齒發育過程中所存在的信號通路不一定是一致的.因此，很有必要對人類牙齒發育過程中所存在的信號通路進行單獨深入地研究.本研究前期工作中已經利用RNA原位雜交和Real-time PCR檢測β-Catenin和Wnt5a基因在人牙胚發育過程的mRNA表達模式［10］，但是其蛋白水平的表達模式還不清楚.本研究繼續以人牙胚為材料，利用免疫組化技術檢測β-Catenin和Wnt5a蛋白在人牙齒早期發育過程中的表達模式.將β-Catenin和Wnt5a的mRNA和蛋白水平的表達模式進行比較，同時與這些基因在模式動物小鼠牙齒發育過程中的表達模式進行比較，從而為揭示潛藏在牙齒發育過程中的分子機理提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

人胚胎從醫院獲取，胎齡為12～15 W，所有標本均得到患者本人或家屬知情同意，并按照福建師范大學動物倫理委員會的相關規定執行.羊抗人β-Catenin單克隆抗體（abcam公司），兔抗人Wnt5a單克隆抗體（R&D公司），山羊二抗、兔二抗和濃縮型DAB試劑盒(中山金橋公司).

1.2 方法

1.2.1 人牙胚固定、包埋及切片

在解剖鏡下分離人胚胎下頜，并將下頜從中間切開分為左、右對等兩半的斷面部分（矢狀切）.將其置于4%多聚甲醛中固定24 h，4℃條件下10%EDTA脫鈣至組織軟化 （2～8 W）；PBS清洗組織后，30%～100%梯度乙醇脫水，每道1 h；二甲苯透明，每道30 min；石蠟包埋.在切片機進行連續切片，并進行挑片，挑選出具有門牙和磨牙組織的蠟帶分別貼在不同的載玻片上，在展片機上展片15～20 min，60℃烘干后在-20℃下保存備用.

1.2.2 HE染色

二甲苯脫蠟2道，每道15 min；100%、90%、70%、50%、30%梯度乙醇復水和無RNase水各1道，每道5 min；蘇木精染色8～15 min，自來水沖洗2 min；伊紅染色30 s；70%、90%、100%乙醇各1道脫水，每道5 min，100%乙醇重復一次；二甲苯透明，中性樹脂封片.

1.2.3 免疫組織化學

石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水；3%H2O2去離子水，室溫10 min，阻斷內源性過氧化物酶；PBS清洗；檸檬酸進行抗原熱修復20 min；PBS清洗；正常羊血清封閉非特異性位點1 h，室溫；添加一抗（β-Catenin稀釋500倍，Wnt5a稀釋50倍），4℃過夜；PBS清洗；按照一抗的來源，分別加入相應的二抗，37℃孵育1 h；PBS清洗；DAB顯色，鏡下觀察；ddH2O漂洗，終止顯色；蘇木精復染、脫水、透明、封片.

2 結果

2.1 人牙胚形態觀察

HE染色結果顯示，人牙胚組織形態與小鼠牙胚組織形態相似，12 W時人牙胚發育處于帽狀期，可觀察到上皮凹陷形成帽狀結構，牙上皮（成釉器）由內向外依次分為內釉上皮層、星網狀層和外釉上皮層.內釉上皮層凹面可見細胞密集成團，即釉結節.間充質聚集形成牙乳頭，牙上皮和牙乳頭外的間充質細胞環狀排列形成牙囊 （圖1A-B）.15 W牙胚處于為鐘狀期早期，牙上皮具有類似倒鐘的形態，內釉上皮層處的凹陷進一步加深，牙囊細胞呈纖維網狀.牙上皮開始分化為成釉質細胞，間充質開始分化為成牙本質細胞.牙上皮由內向外依次分為內釉上皮層、中間層、星網狀層和外釉上皮層（圖1C-F）.

2.2 β-Catenin和Wnt5a蛋白在人牙齒早期發育的表達模式

2.2.1 β-Catenin蛋白的表達

利用免疫組化檢測β-Catenin蛋白在12 W和15 W人門牙和磨牙牙胚的表達模式.結果顯示，在12 W帽狀期時，β-Catenin蛋白在門牙和磨牙的內、外釉上皮層、釉結節、星網狀層和口腔上皮細胞呈強陽性表達，牙上皮下方的牙乳頭呈陽性表達，見圖2A-B.在15 W鐘狀期時，β-Catenin蛋白在門牙和磨牙的內釉上皮、中間層和口腔上皮細胞為強陽性表達，在外釉上皮和星網狀層為弱陽性表達，同時在成釉器的下方的牙乳頭中也有表達見圖2C-d’.結果表明：從12 W帽狀期到15 W鐘狀期，β-Catenin蛋白在門牙和磨牙的牙上皮和間充質均有表達，且在牙上皮細胞的表達均強于牙間充質細胞；在磨牙的表達強于門牙；隨著發育的成熟，在內釉上皮層的表達增強，但是在外釉上皮層和星網狀層的表達降低.

圖1 人牙胚組織形態特征

2.2.2 Wnt5a蛋白的表達

利用免疫組化檢測Wnt5a蛋白在12 W和15 W人門牙和磨牙牙胚的表達模式.結果顯示：在12 W帽狀期時，Wnt5a蛋白于門牙和磨牙的外釉上皮層、內釉上皮層和釉結節，以及內釉上皮層下方的的牙乳頭細胞呈陽性表達，星網狀層呈弱陽性，而口腔上皮和牙囊細胞呈陰性，見圖3A-B.在15 W鐘狀期，Wnt5a蛋白于門牙和磨牙的外釉上皮層、中間層和內釉上皮層下方的牙乳頭細胞呈陽性表達，而內釉上皮層、星網狀層、口腔上皮和牙囊細胞呈陰性，見圖3C-d’.免疫組化的陰性對照是添加PBS為一抗，見圖1E-F.結果表明，從12 W帽狀期到15 W鐘狀期，Wnt5a蛋白在門牙和磨牙的牙上皮和間充質均有表達，且在牙間充質細胞的表達均強于牙上皮細胞；在磨牙的表達強于門牙；隨著發育的成熟，在內釉上皮層和星網狀層的表達降低.

圖2 β-Catenin蛋白在人牙齒早期發育的表達模式

3 討論

本研究以帽狀期和鐘狀期人牙胚為材料，運用免疫組織化學染色技術檢測β-Catenin和Wnt5a在門牙和磨牙中的表達情況.與前期研究的mRNA表達模式［10］進行比較發現，無論是mRNA水平還是蛋白水平，β-Catenin在上皮細胞的表達均強于間充質細胞的表達.在帽狀期和鐘狀期，β-Catenin在內釉上皮層的表達相對更為強烈，且隨著發育的成熟，在內釉上皮層處的表達增加，表明它可能參與該部位的細胞增殖.另外，β-Catenin在磨牙成釉器各部位的表達水平明顯強于門牙中的表達水平.作為非經典Wnt信號通路的代表，Wnt5a呈現了較為不同的表達模式，Wnt5a在上皮細胞的表達均弱于間充質細胞的表達表達水平，整體表達較弱.然而Wnt5a的mRNA在相同時期的人牙胚的表達卻十分強烈［10］，因此很有必要對Wnt5a在人牙胚的mRNA轉錄后調控等環節進行深入研究.將Wnt經典通路與非經典通路的這兩個基因相比較發現，β-Catenin在人牙胚中的表達明顯高于Wnt5a的表達，推測WNT經典信號通路在人牙齒早期發育過程中起到更加重要的作用.

圖3 Wnt5a蛋白在人牙齒早期發育的表達模式

與小鼠帽狀期與鐘狀期牙胚的表達模式進行比較后發現，β-Catenin表達情況與小鼠基本一致［11,12］，即均顯著在牙上皮表達.而Wnt5a的mRNA和蛋白表達模式與小鼠存在差異，即Wnt5a在小鼠牙齒早期發育過程中，僅在間充質表達，而Wnt5a在人牙胚的上皮和間充質均有表達，結果表明Wnt5a在人牙胚的表達范圍更廣.人類牙齒早期發育的形態發生過程雖然與小鼠十分相似，但是小鼠牙齒早期發育過程只需21天，而人類需要280天；而且小鼠僅具有一套牙齒，而人類有兩套相互更替的牙齒（乳牙和恒牙）.這預示人類牙齒發育過程中分子調控機制可能與小鼠不同.從Wnt5a在人與小鼠不同的表達模式來看，Wnt5a可能是人與小鼠牙齒發育不同的關鍵基因之一.

β-Catenin和Wnt5a除了在牙齒形態發生和發育過程中具有重要作用，它的異常表達還與人類口腔疾病的發病機理有關.成釉細胞瘤和牙源性惡性腫瘤中皆發現β-Catenin在腫瘤細胞細胞核中的異常累積，研究表明異常的β-Catenin的表達很可能在上皮牙源性腫瘤的產生中有著重要的作用［13,14］.在成釉細胞瘤中同樣發現Wnt5a的表達異常［15］.這些研究表明β-Catenin和Wnt5a的異常表達與一些口腔腫瘤的形成密切相關.它們在正常人類胚胎牙齒早期發育過程的知識將對這些疾病的發生發展的分子機制的理解以及預測和治療疾病提供重要數據.

本研究在鑒定人牙胚的發育形態的基礎上，利用免疫組織化學技術檢測了β-Catenin和Wnt5a在人牙胚帽狀期和鐘狀期的時空表達模式，β-Catenin在人牙胚的表達強于Wnt5a.結果提示β-Catenin和Wnt5a均參與了人牙齒早期發育的過程，且預示疲勞經典Wnt信號通路在人牙齒早期發育過程中發揮更重要作用.研究結果為了解人類牙齒早期發育的分子機制奠定基礎.同時，與小鼠牙齒發育過程中所積累的有關Wnt/β-Catenin信號通路的數據進行比較，這將有助于進一步理解和完善有關人類乃至哺乳動物器官發育的理論.

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On The expression patterns of β-Catenin and Wnt5a in human tooth germ during the early development of tooth

WANG Bing-mei,LIU Ying,LIN Xin,TANG Ling,ZENG Jin-zhen,LIU Zhi-jian
（Fujian Key Laboratory of Developmental and Neuro Biology,College of Life Science，Fujian Normal University，Fuzhou 350108,Fujian，China）

The paper used human embryos’tooth germ of the cap stage and bell stage as the material.The expression patterns of β-Catenin and Wnt5a in molar and incisor during the development of tooth were studied through immunohistochemistry.The results showed that the expression of β-Catenin in epithelium was stronger than that in mesenchyme.The expression of β-Catenin increased in inner enamel epithelium,but reduced in outer enamel epithelium and stellate reticulum from 12 W to 15 W.Besides,The expression of β-Catenin in the enamel organ of incisor was weaker compared with that of molar;however,the expression of Wnt5a in tooth germ was weak,and Wnt5a was mainly expressed in mesenchyme,suggesting more important role of canonical Wnt pathway in early development of human tooth.

β-Catenin；Wnt5a；human tooth germ；expression patterns

Q257

：A

：1007-5348（2014）08-0073-05

（責任編輯：邵曉軍）

2014-05-04

國家自然科學基金青年科學基金項目（81200761）；教育部博士點基金項目（20123503120005）；福建省自然科學基金項目（2011J01146）；福建省教育廳科技項目（JA12081）；福建師范大學優秀青年骨干教師培養基金（fjsdjk2012077）.

王冰梅（1982-），女，福建南安人，福建師范大學生命科學學院講師，博士，主要從事干細胞與器官發育方面的研究.