高脂血癥對小鼠睪丸StAR和P450scc表達的影響及辛伐他汀的干預作用

王慧君，呂正梅，戎玉羅，王 琦，葉寧寧，程媛媛，張 凱

高脂血癥對小鼠睪丸StAR和P450scc表達的影響及辛伐他汀的干預作用

王慧君1，2，呂正梅1，2，戎玉羅3，王 琦1，2，葉寧寧3，程媛媛3，張 凱4

目的探討高脂血癥（HL）影響小鼠睪丸睪酮合成機制及辛伐他汀（SIMV）的干預作用。方法18只C57BL／6J雄性小鼠隨機均分為3組：HL組、SIMV組和正常對照組（CTRL組）；4個月后測血脂、體重；3β-HSD免疫組化法檢測睪丸間質細胞；RT-PCR法和Western blot法檢測類固醇激素合成急性調節蛋白（StAR）與細胞色素P450膽固醇側鏈裂解酶（P450scc）的表達。結果①HL組和SIMV組體重、總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）明顯高于CTRL組（P＜0.05）；SIMV組體重和TC比HL組顯著下降（P＜0.05），LDL-C無明顯變化。②HL組StAR和P450scc的mRNA與蛋白表達較CTRL組顯著下調（P＜0.05，P＜0.01）；SIMV組較HL組則兩者表達均升高（P＜0.01）。③3β-HSD免疫組化染色顯示各組小鼠睪丸間質細胞數差異無統計學意義。結論SIMV可以改善HL引起的睪丸間質細胞合成睪酮能力下調。

睪丸；StAR；P450scc；高脂血癥；辛伐他汀

代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）是多種代謝成分異常聚集的病理狀態，主要組分包括超重或肥胖、高血壓、高血脂、糖耐量異常和糖尿病、高胰島素血癥伴胰島素抵抗等。高能高脂飲食攝入過多和運動量過少是MS發生的兩大直接誘因［1－3］。MS會對身體機能的許多方面造成損害，性腺機能減退即是其中之一［4］。研究［5－7］表明MS可能通過多種途徑導致雄性性腺機能減退：①外周脂肪組織芳香化作用增強，睪酮向雌二醇轉化增加；②炎癥因子和瘦素分泌增多，使垂體促性腺激素的合成減少或作用減弱；③肥胖抑制雄激素結合球蛋白的合成；④胰島素抵抗可能減少促性腺激素的釋放等。哺乳動物體內95%的雄激素由睪丸間質細胞（Leydig細胞）合成分泌，類固醇激素合成急性調節蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）和細胞色素P450膽固醇側鏈裂解酶（cytochrome P450 side-chain cleavage enzyme，P450scc）是調控Leydig細胞睪酮合成的關鍵蛋白／酶。辛伐他汀（simvastatin，SIMV）為臨床常用降脂藥物，主要作用是降低總膽固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。有文獻［8］報道，SIMV可改善高膽固醇血癥引起的精液質量與雄性生育力下降。該研究采用高脂飲食復制高脂血癥（hyperlipidemia，HL）動物模型，觀察HL小鼠Leydig細胞StAR和P450scc表達水平的改變，同時分析SIMV處理對高脂飲食小鼠睪酮合成能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

18只C57BL／6J雄性小鼠，6周齡，SPF級，體重19～23 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑與儀器

SIMV購自杭州默沙東有限公司；免疫組化SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；抗3β-HSD抗體、抗P450scc多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG均購自武漢博士德生物公司；抗StAR抗體購自美國CST公司；抗βactin抗體購自美國Santa Cruz公司；TRIzol和RTPCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；血脂檢測采用日本OLYMPUS AU640全自動生化分析儀；免疫組化染色攝片采用日本OLYMPUS BX51光學顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 動物分組和飼養 18只C57BL／6J雄性小鼠隨機平均分成3組喂養：①HL組給予高脂飼料（1%膽固醇、10%豬油、10%蛋黃粉、20%蔗糖、59%維持料）喂養，制備HL動物模型；②SIMV組給予相同高脂飼料，并以SIMV 5 mg／（kg·d）灌胃；③正常對照組（CTRL組）給予普通飼料喂養。小鼠均自由攝食、飲水。每周稱量小鼠體重，并根據體重調整SIMV用量。

1.3.2 血脂測定 4個月后實驗結束，摘除小鼠眼球取血，分離血清，檢測血脂。

1.3.3 免疫組化染色 迅速打開小鼠腹腔，取出睪丸組織，固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋、切片，切片常規脫蠟至水，枸櫞酸鹽修復，3%H2O2孵育阻斷內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉；加抗3β-HSD抗體（1∶50），4℃孵育過夜；生物素標記羊抗兔IgG工作液37℃孵育1 h；免疫組化SP工作液37℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復染后脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3.4 RT-PCR法檢測 取新鮮睪丸組織約50 mg，加0.5 ml TRIzol充分勻漿，酚－氯仿法提取組織總RNA。取2 μg總RNA反轉錄獲得cDNA，再進行PCR反應。PCR反應條件為：94℃預變性3 min，94℃變性時間30 s，60℃退火時間30 s，72℃延伸時間20 s，設置循環30次，72℃延伸時間10 min，4℃終止。引物序列見表1。PCR產物于瓊脂糖凝膠中電泳，采用凝膠電泳成像分析系統觀察、拍照。用Gel-Pro Analyzer軟件分析目的條帶灰度值，以目的條帶與β-actin條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA的相對含量。

表1 RT-PCR的引物序列

1.3.5 Western blot法檢測 取約50 mg睪丸組織，加入200 μl RIPA裂解液和2 μl PMSF充分勻漿，提取組織總蛋白，Lowry法測定蛋白濃度并定量。蛋白上樣量取約100 μg，12%SDS-PAGE電泳分離蛋白；恒流轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后TBST洗膜；一抗孵育（抗StAR抗體按1∶1 000稀釋、抗P450scc抗體按1∶200稀釋、抗β-actin抗體按1∶100稀釋）4℃過夜，37℃孵育二抗（按1∶1 000稀釋）1 h；常規TBST洗膜后ECL化學發光，X線片顯影、定影。實驗結果拍照并用Gel-Pro Analyzer軟件進行分析。

1.4 統計學處理

采用SPSS Statistics V17.0統計軟件分析，數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。

2 結果

2.1 體重和血脂

HL組和SIMV組體重、TC和 LDL-C較CTRL組均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；SIMV組體重和TC明顯低于HL組，差異有統計學意義（P＜0.05），LDL-C降低不明顯；各組總三酰甘油（TG）和高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）差異無統計學意義。見表2。

表2 各組小鼠體重與血脂比較（n＝6，±s）

表2 各組小鼠體重與血脂比較（n＝6，±s）

與CTRL組比較：*P＜0.05；與HL組比較：＃P＜0.05

組別體重（g）血脂（mmol／L）TCLDL-CHDL-CTG CTRL32.33±1.971.49±0.430.17±0.031.10±0.440.57±0.04 HL36.33±3.39*2.38±0.45*0.45±0.09*1.75±0.390.49±0.19 SIMV34.00±2.58*＃1.92±0.40*＃0.40±0.04*1.29±0.270.34±0.09 F值4.0835.4315.7474.5918.844

2.2 睪丸Leydig細胞

3β-HSD特異性表達于睪丸組織Leydig細胞細胞質中，陽性染色呈棕黃色，生精小管呈陰性反應。每張切片隨機選取10個400倍高倍鏡視野，光鏡下計數睪丸Leydig細胞數，統計分析顯示各組小鼠睪丸組織Leydig細胞數差異無統計學意義。見圖1、表3。

圖1 各組小鼠睪丸組織Leydig細胞3β-HSD蛋白免疫組化染色×400A：HL組；B：SIMV組；C：CTRL組

表3 各組小鼠睪丸組織Leydig細胞計數均值比較（n＝6，±s）

表3 各組小鼠睪丸組織Leydig細胞計數均值比較（n＝6，±s）

組別Leydig 細胞計數均值CTRL111.4±2.351 HL103.8±1.847 SIMV99.1±2.501

2.3 睪丸組織StAR和P450scc的mRNA表達

HL組睪丸組織Leydig細胞StAR和P450scc的mRNA表達比CTRL組降低（P＜0.05）；經SIMV干預后，StAR和P450scc表達均升高（P＜0.01），見圖2。

圖2 RT-PCR法檢測睪丸組織StAR和P450scc的mRNA水平M：Marker；1：HL組；2：SIMV組；3：CTRL組與CTRL組比較：*P＜0.05；與HL組比較：＃＃P＜0.01

2.4 睪丸組織StAR和P450scc的蛋白表達

睪丸組織Leydig細胞StAR和P450scc蛋白表達在HL組明顯低于CTRL組（P＜0.01）；SIMV組表達較HL組上調（P＜0.01），見圖3。

3 討論

許多臨床資料證實肥胖相關的代謝性疾病能引發睪酮水平低下。本課題以高脂飲食建立HL小鼠模型，研究睪丸Leydig細胞合成睪酮能力的變化及降脂藥SIMV處理后對生殖功能的影響。

該研究結果顯示，高脂飲食誘發HL小鼠的睪丸組織StAR和P450scc的mRNA與蛋白表達較正常飲食小鼠明顯下調；經SIMV處理后，高脂飲食小鼠StAR和P450scc的表達則有顯著增加。StAR調節睪丸Leydig細胞合成睪酮過程的限速步驟：膽固醇由線粒體外膜向內膜的轉移；P450scc調控睪酮合成酶促反應的關鍵步驟：膽固醇側鏈裂解轉化為孕烯醇酮。StAR和P450scc表達下調，表明HL可使Leydig細胞合成睪酮的能力降低。Yamamoto et al［9］研究指出，HL可導致精子發生障礙，部分原因可能由于Leydig細胞的分泌功能受到損害。SIMV可上調StAR和P450scc的表達，表明其對高脂飲食小鼠睪丸的睪酮合成障礙具有保護作用。

圖3 Western blot法檢測睪丸組織StAR和P450scc的蛋白水平1：HL組；2：SIMV組；3：CTRL組與CTRL組比較：**P＜0.01；與HL組比較：＃＃P＜0.01

該研究表明，高脂飲食小鼠睪丸Leydig細胞計數和正常飲食小鼠并無明顯差異。因此，HL小鼠睪丸組織StAR和P450scc的表達下調不是因為Leydig細胞數目有所減少。線粒體結構和功能的完整是Leydig細胞正常合成睪酮所必需的條件［10］。高脂飲食可引起血脂增高，睪丸局部代謝狀態發生改變，產生過量自由基，引發睪丸微環境的氧化應激（OS），使線粒體DNA受到損傷［6］。課題前期研究［11］顯示，HL小鼠睪丸Leydig細胞的線粒體出現空泡化改變。完整的線粒體膜電位也是StAR轉運膽固醇所必需的，而活性氧能夠破壞線粒體膜電位的完整性，繼而影響StAR的轉運效率和睪酮的合成［12］。

有文獻［8］報道，抗氧化劑可以顯著改善高膽固醇血癥引發的精子異常和雄性生育力下降。有研究［13］表明，抗氧化劑褪黑素可有效保護HL導致的小鼠睪丸組織超微結構損傷。SIMV有降脂、降低動脈粥樣硬化的風險等功效；同時，長期應用可以改善與高血脂相關的OS［14］。研究結果顯示，經SIMV處理后的高脂飲食小鼠血清LDL-C略有降低（種屬差異性可能是LDL-C降低不明顯的原因［15］），TC顯著下降。因此推測SIMV可能通過調節血脂代謝紊亂和改善OS，減輕Leydig細胞線粒體結構和功能的損害，從而保護其合成睪酮的能力，保障精子的正常發生。

SIMV可能還通過其他的作用機制保護高脂飲食小鼠Leydig細胞的睪酮合成能力。肥胖及內臟脂肪組織分泌脂肪因子和激素的增加會促進性腺機能減退的發生［5］。超重可負反饋調節下丘腦－垂體－性腺（HPG）軸，使睪酮合成下降。本研究結果表明：SIMV的干預使高脂飲食小鼠體重增加的趨勢得到遏制，從而可能通過減少脂肪組織脂肪因子和激素的分泌，對HPG軸的負反饋調控作用進行調節，進而增加Leydig細胞的睪酮合成，提高體內的睪酮水平。SIMV對HPG軸的影響也值得進一步研究。

本課題闡明了HL導致睪丸Leydig細胞合成睪酮能力下降的分子機制及降脂藥SIMV對高脂飲食小鼠Leydig細胞睪酮合成能力的保護作用，這對HL及MS相關男性生育力下降的預防和治療具有一定的臨床參考意義。

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Effect of simvastatin on expression of StAR and P450scc in testis of mice with hyperlipidemia

Wang Huijun1，2，Lü Zhengmei1，2，Rong Yuluo3，et al
（1Dept of Histology and Embryology，2Central Laboratory of Molecular Function，
3The 2012 General Practice Medicine Specialty，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effect of hyperlipidemia（HL）on the testosterone synthesis of Leydig cells and the protection conferred by simvastatin（SIMV）treatment.MethodsEighteen C57BL／6J male mice were randomlydivided into hyperlipidemia group（HL group），simvastatin treatment group（SIMV group）and control group（CTRL group）.After 4 months，the body weight and serum lipid profiles were detected.Leydig cells were evaluated by 3β-HSD immunohistochemical staining.Expressions of steroidogenic acute regulatory protein（StAR）and cytochrome P450 Cholestero side chain lyase（P450scc）were determined by RT-PCR and Western blot.ResultsThe high-fat diet led to a significant increase in body weight，total cholesterol（TC）and low density lipoprotein cholesterol（LDL-C）in HL group and SIMV group as compared to CTRL group（P＜0.05）.A significant decrease in body weight and serum TC was noticed in SIMV group in comparison with HL group（P＜0.05）.The decreased mRNA and protein expressions of testicular StAR and P450scc were observed in hyperlipidemic mice as compared to CTRL group（P＜0.05，P＜0.01）.The StAR and P450scc expressions were significantly improved in SIMV group in comparison with the HL group（P＜0.01）.There were no significant differences of Leydig cells number among these experimental groups.ConclusionSIMV may have a role in protecting Leydig cell function against metabolic damage caused by HL.

testis；StAR；P450scc；hyperlipidemia；simvastatin

R 322.64；R 361.2；R 589.2

A

1000－1492（2014）06－0711－05

2013－12－20接收

安徽省高等學校省級自然科學研究面上項目（重點）（編號：KJ2013A148）；2013年國家級大學生創新創業訓練計劃項目（編號：0111015103）

安徽醫科大學1組織胚胎學教研室、2分子機能中心實驗室、32012級全科專業，合肥 2300324安徽中醫藥大學組胚生物學教研室，合肥 230038

王慧君，女，碩士研究生；

呂正梅，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：lvzm99＠126.com