自噬對巨噬細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌的影響

呂允相，吳惠梅，方 磊，劉榮玉

自噬對巨噬細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌的影響

呂允相，吳惠梅，方 磊，劉榮玉

目的探討金黃色葡萄球菌（簡稱金葡菌）對巨噬細(xì)胞自噬的影響，并研究其在巨噬細(xì)胞吞噬病原微生物中的作用。方法以小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7為研究對象，以磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）為干預(yù)藥物，空白處理作為對照組，金葡菌感染作為實(shí)驗(yàn)組，3-MA干預(yù)作為抑制組。金葡菌感染細(xì)胞后，Western blot檢測自噬蛋白Beclin1、LC3以及吞噬相關(guān)蛋白R(shí)ac1的表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡觀察自噬、吞噬現(xiàn)象。結(jié)果金葡菌感染RAW264.7 1 h后，實(shí)驗(yàn)組LC3Ⅱ和PI3K蛋白表達(dá)最強(qiáng)（P＜0.05），抑制組Beclin1和LC3Ⅱ表達(dá)顯著降低（P＜0.05），自噬顆粒聚集顯著減少（P＜0.05），Rac1表達(dá)顯著降低（P＜0.05），同時(shí)，RAW264.7吞噬金葡菌數(shù)目顯著減少（P＜0.05）。結(jié)論金葡菌誘導(dǎo)的自噬增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞吞噬能力，自噬抑制劑3-MA抑制PI3K活性的同時(shí)，減弱了巨噬細(xì)胞自噬吞噬金葡菌的能力。

吞噬；自噬；巨噬細(xì)胞；磷脂酰肌醇3激酶；金黃色葡萄球菌

外來微生物進(jìn)入身體無菌部位時(shí)，巨噬細(xì)胞通過趨化作用黏附、內(nèi)化這些病原體，最終被清除，并產(chǎn)生細(xì)胞因子，誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)機(jī)體組織和器官［1］。自噬是哺乳動(dòng)物細(xì)胞降解自身老化細(xì)胞器和蛋白集聚體必不可少的穩(wěn)態(tài)過程，營養(yǎng)缺乏和免疫信號激活都能夠誘導(dǎo)自噬從而清除細(xì)胞自身成分。研究［2］表明自噬具有橋接先天免疫和后天免疫的功能，自噬通路能夠平衡免疫和炎癥，從而對抗感染、自身免疫病和炎癥性疾病。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）家族是一類磷酸化酶，目前已知的有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型都在自噬中有重要作用，Ⅰ型PI3K通過激活下游蛋白參與自噬，而Ⅲ型PI3K通過與Beclin1蛋白結(jié)合參與自噬過程［3］。酵母多糖可以通過Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）招募Beclin1和激活PI3K誘導(dǎo)RAW264.7發(fā)生自噬［4］。金黃色葡萄球菌（簡稱金葡萄）是一種革蘭陽性球菌，臨床上分為耐甲氧西林金葡菌與甲氧西林敏感性金葡菌，其致病性主要是其細(xì)胞壁成分及產(chǎn)生外毒素和酶，然而金葡菌刺激巨噬細(xì)胞后能否誘導(dǎo)其自噬，以及自噬過程的激活能否增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬病原微生物尚不清楚。該實(shí)驗(yàn)以小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7為研究對象，研究金葡菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬對其吞噬能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系及菌株 小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7購于上海細(xì)胞庫；金黃色葡萄球菌NCTC8325由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院孫寶林教授饋贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購于美國Invitrogen公司；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒購于中國Solarbio公司；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）購于美國Sigma公司；LC3多克隆抗體購于美國Novus Biologicals公司；PI3K、Beclin1和Rac1單克隆抗體購于美國Cell Signaling公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的GAPDH和β-actin一抗購于中國康城公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔和兔抗鼠二抗購于美國Santa Cruz Biotechnology公司；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購于美國Corning公司；LSM510激光共聚焦顯微鏡購于德國蔡司公司；ELX800酶標(biāo)儀購于美國Bio-Tek instruments公司；蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U／L青霉素和100 μg／ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞數(shù)目形態(tài)2～3 d傳代1次，保持細(xì)胞處于對數(shù)生長期。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng) 金葡菌在0.1%氯霉素的LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g／L；酵母提取物5 g／L；氯化鈉10 g／L）中培養(yǎng)20 h后，測定其650 nm處吸光度（optical density，OD650）（OD650＝5.0，約5×109／ml），16%甘油凍存，－80℃保存。

1.2.3 金葡菌感染細(xì)胞 將對數(shù)生長期的RAW264.7按1×106／ml的密度分別接種6孔板，培養(yǎng)過夜。PBS清洗金葡菌3次，用不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基重懸并稀釋，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為100∶1（細(xì)菌∶細(xì)胞）加入培養(yǎng)板中感染細(xì)胞。將實(shí)驗(yàn)分為3組：空白處理作為對照組，金葡菌感染作為實(shí)驗(yàn)組，3-MA干預(yù)作為抑制組。

1.2.4 MTT檢測3-MA作用下RAW264.7活力PBS沖洗細(xì)胞后，加入0.25%胰酶消化，待細(xì)胞形態(tài)變圓時(shí)棄去胰酶，用培養(yǎng)基輕輕吹落細(xì)胞，計(jì)數(shù)將細(xì)胞密度控制在5×104／ml，種于96孔板中36孔，每孔100 μl，96孔板四周孔加入PBS，每孔100 μl，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞完全貼壁，密度約90%后，分別加入0、1.25、2.5、5和10 mmol／L 3-MA處理2 h后，棄去培養(yǎng)基加入新鮮培養(yǎng)基，每孔加入5%MTT（0.5 mg／ml）10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，向每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μl，在搖床上搖15 min，整個(gè)過程避光操作。紫色結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀檢測各孔于490 nm波長處的吸光值。細(xì)胞存活（%）＝（加藥組吸光度／對照組吸光度）× 100%。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及自噬吞噬觀察 取對數(shù)期RAW264.7，計(jì)數(shù)約1×106／ml接種于玻璃底動(dòng)態(tài)皿中，培養(yǎng)過夜，按Lipofectmine 2000說明書轉(zhuǎn)染GFP-LC3，轉(zhuǎn)染后，各組細(xì)胞處理如1.2.3所示，之后去除上清液，用PBS沖洗2次，加入10%甲醛固定10 min，棄去甲醛用PBS沖洗3次，最后加入1 ml PBS 4℃保存待激光共聚焦顯微鏡鏡下觀察。

1.2.6 蛋白提取和Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 12孔板中細(xì)胞處理如1.2.3所示，之后加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑細(xì)胞裂解液在冰上裂解細(xì)胞30 min，吹打裂解的細(xì)胞獲取混合液于4℃12 000 r／min離心15 min，收集上清液加入等體積2×loading buffer混勻，煮沸10 min，－20℃保存。采用SDS-PAGE凝膠電泳法，下層12%分離膠，上層5%濃縮膠，蛋白上樣，120 V恒壓電泳1.5 h后，280 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF蛋白膜上，根據(jù)預(yù)染蛋白Marker，剪下不同的蛋白于濕盒內(nèi)孵育相應(yīng)一抗（稀釋比例：LC3 1∶5 000；Beclin1 1∶2 000；PI3K 1∶1 000；Rac1 1∶1 000；GAPDH 1∶2 000；β-actin 1∶2 000），4℃過夜后室溫1 h，TBST洗膜3次，每次15 min，室溫孵育二抗1 h（稀釋比例：1∶2 000），TBST洗膜3次，每次15 mim，ECL A、B液等體積混合后敷于蛋白膜上，于化學(xué)發(fā)光成像ChemiScope顯影。運(yùn)用Image J軟件對蛋白灰度值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 3-MA對RAW264.7活力的影響

3-MA預(yù)處理RAW264.7 2 h后，MTT比色法測得各組細(xì)胞活力相對百分比結(jié)果顯示3-MA濃度為5 mmol／L時(shí)顯著影響細(xì)胞活力（F＝20.08，P＜0.05），見表1。3-MA是一種特異性自噬抑制劑，在不影響RAW264.7活力的情況下，根據(jù)結(jié)果選擇其最適濃度為2.5 mmol／L，因此在接下來的實(shí)驗(yàn)中使用3-MA的濃度為2.5 mmol／L。

表1 3-MA預(yù)處理2 h對RAW264.7活力的影響（n＝6，±s）

表1 3-MA預(yù)處理2 h對RAW264.7活力的影響（n＝6，±s）

與5 mmol／L組比較：*P＜0.05

3-MA（mmol／L）細(xì)胞活力（%）0 84.36±9.87*1.2581.38±2.22*2.581.24±3.55*5 59.43±3.16 1040.77±2.05*

2.2 不同感染時(shí)間對RAW264.7 PI3K和LC3蛋白表達(dá)量的影響研究金葡菌誘導(dǎo)的RAW264.7自噬作用，金葡菌感染時(shí)間分別設(shè)為0、15、30、45、60、75、90、105、120、180和240 min。采用Western blot檢測蛋白PI3K和LC3表達(dá)量。金葡菌感染1 h，PI3K和LC3Ⅱ表達(dá)量最高（P＜0.05），見圖1。

2.3 抑制PI3K活性下調(diào)了RAW264.7自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)和自噬顆粒的聚集3-MA預(yù)處理RAW264.7后，金葡菌感染后，Western blot檢測PI3K、Beclin1和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)組和抑制組PI3K表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組與對照組LC3Ⅱ表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.001 9）；實(shí)驗(yàn)組與抑制組LC3Ⅱ表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.001 1）；對照組與抑制組LC3Ⅱ表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對照組與實(shí)驗(yàn)組Beclin1表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.021 9）；實(shí)驗(yàn)組與抑制組Beclin1表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000 3）。見圖2。同時(shí)，激光共聚焦觀察LC3自噬顆粒聚集。實(shí)驗(yàn)組（6.27±0.405）帶綠色熒光LC3自噬顆粒表達(dá)量較對照組（1.16± 0.334）、抑制組（2.17±0.176）顯著增加（P＜0.01），見圖3。

圖1 金葡菌感染RAW264.7不同時(shí)間后，Western blot檢測PI3K和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量與金葡萄感染60 min組比較：*P＜0.05

圖2 金葡菌感染RAW264.7后PI3K、LC3Ⅱ及Beclin1表達(dá)量1：對照組；2：實(shí)驗(yàn)組；3：抑制組；與實(shí)驗(yàn)組比較：*P＜0.05；與對照組比較：＃P＜0.05

圖3 激光共聚焦下觀察RAW264.7細(xì)胞自噬現(xiàn)象×630A：對照組；B：實(shí)驗(yàn)組；C：抑制組

2.4 抑制PI3K活性下調(diào)了RAW264.7吞噬相關(guān)蛋白的表達(dá)和吞噬金葡菌的數(shù)目3-MA預(yù)處理RAW264.7后，用約1×108／ml金葡菌感染細(xì)胞后，Western blot檢測Rac1蛋白表達(dá)量。對照組與實(shí)驗(yàn)組Rac1表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000 1）；實(shí)驗(yàn)組與抑制組Rac1表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)意義（P＝0.047 3），見圖4。同時(shí)，激光共聚焦觀察RAW264.7吞噬金葡菌的數(shù)目。圓形或橢圓形表面有突起的是RAW264.7，細(xì)胞上吞噬的圓點(diǎn)為金葡菌，抑制組（8.37±0.397）RAW264.7吞噬金葡菌比實(shí)驗(yàn)組（11.90±0.601）顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖5。

圖4 金葡菌感染后RAW264.7 Rac1表達(dá)量1：對照組；2：實(shí)驗(yàn)組；3：抑制組；與實(shí)驗(yàn)組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

圖5 激光共聚焦下觀察RAW64.7吞噬現(xiàn)象 ×630A：實(shí)驗(yàn)組；B：抑制組

3 討論

金葡菌與過敏性疾病如哮喘相關(guān)，近期研究［5］表明哮喘患者血清中常含有特異性金葡菌外毒素抗體IgE，而且IgE濃度與哮喘嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。金葡菌外空泡可以誘導(dǎo)氣道中性粒細(xì)胞Th1和Th17反應(yīng)，同時(shí)可以增強(qiáng)氣道高反應(yīng)性［6］。因此，有效清除氣道內(nèi)金葡菌可能減輕哮喘癥狀及其發(fā)作。

肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophages，AMs）是氣道先天性免疫的第一道屏障，能監(jiān)測和清除病原體并啟動(dòng)早期宿主免疫反應(yīng)，激素依賴性哮喘患者AMs吞噬凋亡細(xì)胞的能力明顯降低［7］。Simpson et al［8］也發(fā)現(xiàn)非嗜酸粒細(xì)胞性哮喘患者痰中巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的能力也明顯降低。臨床上激素治療非嗜酸性粒細(xì)胞性哮喘不理想。因此，調(diào)控AMs對病原體的吞噬可能是哮喘治療一個(gè)潛在策略。Rac1是Rho家族蛋白之一，活化Rac1引起細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)改變，進(jìn)而膜褶皺形成吞噬杯調(diào)節(jié)吞噬［9］。Tanaka et al［10］在肺炎小鼠AMs中顯示激活Rac1后上調(diào)對凋亡細(xì)胞的吞噬。本實(shí)驗(yàn)顯示金葡菌感染RAW264.7 1 h后，PI3K蛋白表達(dá)量明顯升高。3-MA抑制PI3K活性后，Rac1蛋白表達(dá)量顯著降低，吞噬率顯著降低，提示激活PI3K可能參與了吞噬。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)顯示抑制Rac1表達(dá)后，RAW264.7吞噬金葡菌能力降低，與Shen et al［11］認(rèn)為抑制Rac1活性減弱了肌動(dòng)蛋白的聚集，降低了小鼠巨噬細(xì)胞對李斯特菌的吞噬的研究一致。以上結(jié)果提示RAW264.7 Rac1的活化是依賴PI3K的。

自噬蛋白Beclin1是Atg6的哺乳動(dòng)物同源類似物，參與Ⅲ類PI3K復(fù)合物的形成同時(shí)招募其他蛋白促進(jìn)自噬吞噬體膜形成［12］。LC3是Atg8的哺乳動(dòng)物同源物，通過Atg4水解C端形成胞質(zhì)LC3Ⅰ，之后與磷脂酰乙醇胺共價(jià)結(jié)合形成膜LC3Ⅱ。LC3Ⅱ持續(xù)存在于自噬體膜，是目前自噬吞噬體最可靠的標(biāo)志蛋白［13］。研究［14］顯示，在中重度哮喘患者上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了大量自噬顆粒聚集，也顯示自噬基因Atg5固有單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）rs 2212740序列與哮喘相關(guān)，而且此序列與哮喘患者一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1）相關(guān)，因此推測自噬可能是參與氣道重塑和肺功能降低的細(xì)胞機(jī)制。Mestre et al［12］研究發(fā)現(xiàn)，金葡菌能夠通過降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬，本研究發(fā)現(xiàn)金葡菌感染1 h后，PI3K蛋白表達(dá)量最高，Beclin1和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)顯著升高，而且細(xì)胞GFPLC3顆粒聚集顯著升高，提示PI3K參與了金葡菌誘導(dǎo)的RAW264.7自噬；抑制PI3K活性后，自噬蛋白表達(dá)顯著降低，GFP-LC3顆粒聚集也顯著降低，進(jìn)一步提示金葡菌通過PI3K介導(dǎo)了RAW264.7的自噬。

本實(shí)驗(yàn)以小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7為研究對象，在金葡菌感染的情況下，抑制PI3K活性為手段，探討RAW264.7自噬吞噬過程。該實(shí)驗(yàn)示金葡菌誘導(dǎo)了RAW264.7自噬，且感染1 h時(shí)自噬蛋白表達(dá)量達(dá)到最高。3-MA抑制PI3K活性后，RAW264.7自噬蛋白表達(dá)和自噬顆粒聚集顯著降低，且對金葡菌吞噬黏附也顯著降低。總之，PI3K介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬可能是調(diào)節(jié)其吞噬作用的機(jī)制。

綜上所述，雖然本研究顯示PI3K在金葡菌感染的小鼠單核巨噬細(xì)胞系誘導(dǎo)的自噬過程中起著很重要的作用，抑制PI3K活性下調(diào)了自噬和吞噬，此結(jié)果可能為研究金葡菌與AMs在哮喘中的作用提供理論基礎(chǔ)，但此過程只局限于體外研究，小鼠巨噬細(xì)胞系并不能等同于AMs。因此，本實(shí)驗(yàn)需要更進(jìn)一步的研究去探索金葡菌誘導(dǎo)小鼠哮喘模型AMs自噬對吞噬的影響。

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The effect of autophay on the Staphylococcus aureus phagocytosized by macrophages

Lü Yunxiang，Wu Huimei，F(xiàn)ang Lei，et al

（Dept of Geriatrics Respiratory，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo study the effect of Staphylococcus aureus on autophagy in macrophages and the role of autophagy in the pathogens phagocytosis by macrophages.MethodsMouse monocyte-macrophage cell line RAW264.7 was used，before infecting by Staphylococcus aureus，RAW264.7 cells were pretreated by phosphatidylinositol3-kinase（PI3K）inhibitor，3-MA.Blank treatment was served as control group，infected by Staphylococcus aureus was served as experimental group and pretreated by 3-MA was served as inhibited group.The protein expression levels of LC3，Beclin1 and Rac1 were measured by Western blot，the process of autophagy and phagocytosis were viewed by Confocal Scanning Laser Microscope.ResultsThe protein expression levels of LC3Ⅱand PI3K were increased after infected by Staphylococcus aureus for 1 h（P＜0.05）.Compared to that in experimental group，the protein expression levels of LC3Ⅱand Beclin1（P＜0.05），the aggregation of autophagy puncta were significantly decreased in inhibited group（P＜0.05）.Similarly，the protein level of Rac1（P＜0.05）and the phagocytosis of Staphylococcus aureus in RAW264.7 were significantly reduced in inhibited group（P＜0.05）.ConclusionAutophagy induced by Staphylococcus aureus strengthens the phagocytosis of macrophages，and autophagy and phagocytosis in macrophages are down-regulated via inhibiting PI3K activity by 3-MA.

phagocytosis；autophagy；macrophage；phosphatidylinositol-3-kinase；Staphylococcus aureus

R 378.1

A

1000－1492（2014）06－0706－05

2014－02－17接收

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號：81270082、81170030）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（編號：20113420110006）；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號：12010402135）；重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室計(jì)劃項(xiàng)目（編號：1206c0805028）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年呼吸內(nèi)科，合肥

230022

呂允相，男，碩士研究生；劉榮玉，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：rongyuliu＠gmail.com