基質金屬蛋白酶1及其抑制劑在白藜蘆醇治療佐劑性關節炎中的表達

安 梅，孫和炎，盧錦森，馬中飛，縱何香，葉桂萍，郭利梅，何舒寧，陳曉宇

◇基礎醫學研究◇

基質金屬蛋白酶1及其抑制劑在白藜蘆醇治療佐劑性關節炎中的表達

安 梅1，2，孫和炎3，盧錦森4，馬中飛4，縱何香4，葉桂萍4，郭利梅4，何舒寧4，陳曉宇1

目的觀察基質金屬蛋白酶1（MMP-1）及其抑制劑（TIMP-1）在白藜蘆醇治療佐劑性關節炎（AA）的滑膜組織和關節軟骨中的表達，探討MMP-1及TIMP-1的異常表達是否參與AA的發病機制。方法60只SD大鼠隨機分為2組：正常組（10只），模型組（50只）。模型組弗氏完全佐劑注射誘導關節炎12 d后，在其足趾出現繼發性免疫炎癥反應時，又隨機分成4組：模型對照組、白藜蘆醇低劑量組（5 mg／kg）、白藜蘆醇高劑量組（15 mg／kg）、陽性對照雷公藤多苷組（100 mg／kg）。大鼠每天均灌胃給予溶媒或藥物，持續16 d后處死大鼠；免疫組化法檢測滑膜組織MMP-1、TIMP-1表達；滑膜組織勻漿，Western blot法檢測MMP-1、TIMP-1蛋白含量。結果白藜蘆醇能明顯抑制模型組大鼠病理損害程度，模型組滑膜組織MMP-1、TIMP-1高表達，白藜蘆醇治療組能抑制MMP-1、TIMP-1的高表達，在抗關節炎的作用上有相關性。結論白藜蘆醇具有抑制AA大鼠的炎癥作用，防止關節退變的病理變化，其機制與調節大鼠的基質金屬蛋白酶在滑膜組織和關節軟骨的表達有關。

佐劑性關節炎；白藜蘆醇；基質金屬蛋白酶1；基質金屬蛋白酶抑制劑-1；免疫印跡；大鼠

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關節滑膜炎癥和關節破壞為特征的慢性自身免疫性疾病，其病理特點表現為滑膜細胞類腫瘤樣增生，引起軟骨及骨的破壞。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一族降解幾乎所有細胞外基質（extracellular matrix，ECM）為主要功能的酶，若MMPs分泌過量，或與MMPs抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs）比例失衡，將導致滑膜組織和軟骨的ECM過量降解，在RA的發生及發展過程中起著重要的作用［1］。白藜蘆醇是一種天然活性多酚化合物，主要存在于虎杖、葡萄等植物中，白藜蘆醇口服在腸道以葡萄糖醛酸酯形式吸收，其吸收和消除均較快。白藜蘆醇具有抗增殖及調節免疫等多重功效，為RA等疾病的治療提供了新的思路，其可能在抗風濕的同時減少免疫抑制劑的使用，降低RA復發，改善患者預后［2］。筆者應用免疫組織化學法、Western blot法檢測佐劑性關節炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠滑膜組織MMP-1、TIMP-1的表達，以探討其與AA大鼠軟骨和骨的退變之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及給藥

健康雄性SD大鼠，清潔級，體重160～180 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心。大鼠自由攝食飲水，室溫（25±2）℃，適應環境1周后隨機分為2組：正常組（10只）、模型組（50只）。模型組以弗氏完全佐劑（freund＇s complete adjuvant，FCA）（卡介苗80℃、1 h滅活后與高壓消毒的液體石蠟充分碾磨混勻，配成10 mg／ml的乳劑）于每鼠右后足趾皮內注射0.1 ml致炎。于致炎第12天，模型組大鼠隨機均分為4組：模型對照組，白藜蘆醇低、高劑量（5、15 mg／kg）組和陽性藥雷公藤多苷（100 mg／kg）對照組，每周稱體重1次，根據體重適時調整用藥劑量，連續灌胃（10 ml／kg）給藥16 d，正常組及模型組給予等劑量溶媒的0.5%（m／V）羧甲基纖維素鈉。

1.2 主要儀器與試劑

足跖容積測量儀YLS-TA購自山東醫學科學院；全自動高速冷凍離心機GL20A購自湖南儀器儀表總廠；白藜蘆醇購自美國Sigma公司，純度＞98%，溶于無菌0.5%羧甲基纖維素鈉中；兔抗大鼠MMP-1、TIMP-1一抗均購自美國Santa Cruz公司；生物素化山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；BCA試劑盒、ECL化學發光試劑盒購自美國Amersham Life Sciences公司。

1.3 關節炎癥指數評分參照課題組先前建立的方法［3］，在AA大鼠致炎后第12天，每4 d進行一次關節炎指數評分，記錄各組大鼠多發性關節炎病變的發生和嚴重程度。每只足爪按以下標準評分：0分，正常；1分，踝關節紅斑和輕微腫脹；2分，踝關節至跖關節或掌關節紅斑和輕微腫脹；3分，踝關節至跖趾關節或掌關節紅斑和中度腫脹；4分，踝關節到趾關節紅斑和重度腫脹，最高評分12分。用排水法測定大鼠左踝關節（非致炎側）以下的容積變化（Δml），以致炎后－致炎前的差值表示其腫脹度，觀察各組大鼠繼發性炎癥腫脹情況。第28天麻醉下處死各組大鼠，每組4只進行石蠟包埋形態學檢查，另6只迅速取踝關節滑膜組織，液氮凍存，檢測MMP-1和TIMP-1蛋白表達。

1.4 踝關節免疫組化SP染色和軟骨細胞MMP-1和TIMP-1陽性細胞分數計數按照SP試劑盒說明書操作，大鼠踝關節以4%多聚甲醛固定，脫鈣，脫水，石蠟包埋，5 μm厚連續切片，采用SP法進行免疫組化染色：3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，微波行抗原修復，5%羊血清封閉20 min，分別滴加兔抗大鼠MMP-1和TIMP-1單克隆抗體（濃度1∶200），4℃孵育過夜，滴加生物素化羊抗兔IgG二抗，37℃孵育20 min，DAB顯色、蘇木精復染、脫水、透明、封片，光鏡下觀察。每項檢測均設陰性對照，以PBS代替一抗。光鏡下組織切片呈棕黃色顆粒性沉積區域為陽性染色部位。參照文獻［4］計算陽性細胞細胞分數，每張MMP-1、TIMP-1免疫組化切片隨機選取9個視野，其中軟骨表層、中層和下層各3個視野，在400倍光鏡下，計算每個視野的MMP-1、TIMP-1陽性細胞數和細胞總數，用細胞分數（%）＝陽性細胞數／細胞總數×100%表示，最大值為100%。由兩位獨立的觀察者分別對每張切片進行細胞計數，評分誤差率控制在5%以內，取兩者均值計分。

1.5 Western blot法檢測MMP-1和TIMP-1蛋白表達將液氮中凍存的各組滑膜組織分別取樣，按BCA試劑盒說明書操作，測定總蛋白含量后分裝，置－80℃冰箱備用。各組蛋白分別取50 μg，煮沸變性，進行SDS-PAGE分離，將蛋白質電轉移法至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜在10%脫脂奶粉的PBST緩沖液中4℃封閉過夜，分別加兔抗鼠MMP-1（1∶1 500）和TIMP-1（1∶1 500）和兔抗鼠β-actin抗體（1∶1 000），37℃孵育2 h，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1∶1 000），37℃孵育2 h，ECL試劑盒化學熒光法顯色，利用Image J灰度分析軟件Western blot結果作半定量分析。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 白藜蘆醇對大鼠繼發炎癥的影響

致炎后模型組大鼠右足（注射測）開始腫脹，出現繼發性炎癥病變（對側）出現于致炎后的第12天左右，表現為左側和前足腫脹，呈進行性加重，行動不便，站立不穩。模型組大鼠左足較相應時間點的正常組足爪關節明顯腫脹，差異有統計學意義（P＜0.01）；白藜蘆醇治療組和雷公藤多苷組降低了AA大鼠多發性關節炎指數，白藜蘆醇大劑量治療組較小劑量組更為明顯，見表1。

2.2 白藜蘆醇對AA大鼠繼發性足腫脹的影響

表1 白藜蘆醇對AA大鼠繼發炎癥的多發性關節炎指數評分的影響（n＝10，±s）

表1 白藜蘆醇對AA大鼠繼發炎癥的多發性關節炎指數評分的影響（n＝10，±s）

與正常組比較：ΔΔP＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

組別多發性關節炎指數第12天第16天第20天第24天第28天正常0.58±0.820.79±1.060.91±1.120.97±1.220.96±1.42模型5.8±2.2ΔΔ6.9±2.6ΔΔ8.3±2.8ΔΔ9.2±2.7ΔΔ7.52±2.27ΔΔ白藜蘆醇（5 mg／kg）5.7±1.65.9±2.26.2±2.3*6.9±2.7*4.9±1.7**白藜蘆醇（15 mg／kg）5.3±1.85.7±1.95.5±1.8**5.4±1.9**3.7±1.4**雷公藤多苷（100 mg／kg）5.6±1.75.8±2.25.4±1.9**4.9±1.8**3.9±1.5**

通過足趾排水法測定大鼠非致炎側足趾踝關節容積變化（Δml），以致炎后－致炎前的差值表示其腫脹度，自致炎第12天起，連續灌胃給藥16 d，并在不同時間測定AA大鼠非致炎側足爪容積，觀察白藜蘆醇對AA大鼠繼發性足腫脹的影響。見表2。與AA模型組比較，白藜蘆醇自用藥8 d后開始發揮療效，白藜蘆醇（5、15 mg／kg）和陽性藥雷公藤多苷可明顯抑制AA大鼠的繼發性足腫脹，以15 mg／kg白藜蘆醇組作用更為顯著。

表2 白藜蘆醇對AA大鼠繼發性足腫脹病變的影響（n＝10，±s）

表2 白藜蘆醇對AA大鼠繼發性足腫脹病變的影響（n＝10，±s）

與正常組比較：ΔΔP＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

組別足腫脹度（Δml）第12天第16天第20天第24天第28天正常0.09±0.080.12±0.050.15±0.050.22±0.080.24±0.07模型0.47±0.17ΔΔ0.55±0.17ΔΔ0.73±0.27ΔΔ0.91±0.31ΔΔ0.74±0.26ΔΔ白藜蘆醇（5 mg／kg）0.41±0.160.48±0.130.56±0.18*0.73±0.24*0.57±0.18*白藜蘆醇（15 mg／kg）0.42±0.170.47±0.210.53±0.17*0.62±0.25**0.41±0.20**雷公藤多苷（100 mg／kg）0.39±0.160.45±0.180.47±0.14**0.58±0.21**0.47±0.21**

2.3 免疫組織化學法觀察白藜蘆醇對AA大鼠踝關節的MMP-1、TIMP-1蛋白表達和軟骨細胞分數的影響MMP-1、TIMP-1蛋白陽性反應為黃色或棕黃色顆粒，主要定位于滑膜組織及軟骨的胞核和胞質中。實驗結果表明，在AA大鼠滑膜襯里層細胞胞質內MMP-1、TIMP-1亞基呈高表達狀態；而不同濃度的白藜蘆醇明顯降低了MMP-1、TIMP-1在滑膜組織及軟骨組織中的表達，且隨著白藜蘆醇治療濃度的增加，MMP-1、TIMP-1蛋白陽性反應逐漸減弱，見圖1，提示白藜蘆醇可能通過影響MMP-1、TIMP-1的活性而改善AA模型大鼠的基質的失衡狀態。每張MMP-1、TIMP-1免疫組化切片隨機選取9個視野，計算MMP-1、TIMP-1陽性細胞分數，AA模型大鼠軟骨細胞MMP-1、TIMP-1陽性細胞計數明顯高于正常組，而雷公藤多苷和不同濃度的白藜蘆醇明顯降低了AA大鼠MMP-1、TIMP-1的軟骨細胞的陽性細胞計數，且隨著白藜蘆醇治療濃度的增加，MMP-1、TIMP-1軟骨細胞的陽性細胞計數越小，提示白藜蘆醇能改善AA模型大鼠的軟骨細胞的失衡功能狀態，見表3。

2.4 白藜蘆醇對關節滑膜組織中MMP-1、TIMP-1蛋白表達的影響與正常組比較，模型組關節滑膜組織中MMP-1、TIMP-1的表達明顯上調，而白藜蘆醇各劑量組滑膜組織中MMP-1、TIMP-1蛋白表達水平遠低于模型組，但仍高于正常組。與模型組比較，雷公藤多苷治療組兩蛋白表達也降低。凝膠成像系統分析表明，白藜蘆醇對AA大鼠滑膜組織MMP-1、TIMP-1蛋白表達，經5、15 mg／kg白藜蘆醇治療AA模型大鼠滑膜組織MMP-1、TIMP-1蛋白較AA模型滑膜組織明顯降低，見圖2。

圖1 大鼠踝關節免疫組化結果 SP×400A：正常組；B：模型組；C：白藜蘆醇（5 mg／kg）組；D：白藜蘆醇（15 mg／kg）組；E：雷公藤多苷（100 mg／kg）組；1：MMP-1；2：TIMP-1

表3 MMP-1、TIMP-1在各組動物模型軟骨中表達的細胞分數（n＝24，±s）

表3 MMP-1、TIMP-1在各組動物模型軟骨中表達的細胞分數（n＝24，±s）

與正常組比較：ΔΔP＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

項目正常組模型組白藜蘆醇（5 mg／kg）組白藜蘆醇（15 mg／kg）組雷公藤多苷（100 mg／kg）組MMP-17.26±0.8359.82±9.26ΔΔ26.12±7.31*14.90±1.75**15.70±1.82**TIMP-12.42±0.877.58±1.66ΔΔ4.54±1.87*3.42±1.43**4.09±1.27*

圖2 Western blot分析不同濃度白藜蘆醇作用AA大鼠滑膜組織MMP-1、TIMP-1蛋白表達（n＝3，±s）1：正常組；2：模型組；3：白藜蘆醇（5 mg／kg）組；4：白藜蘆醇（15 mg／kg）組；5：雷公藤多苷（100 mg／kg）組；與正常組比較：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

3 討論

TIMPs是MMPs的特異性抑制物，對維持軟骨基質合成與降解的平衡有重要的生理意義，MMPs異常表達和其抑制劑TIMP間動態平衡的失調是目前RA發病機制研究熱點之一。膠原酶亞族MMP-1可降解基質的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅷ、Ⅹ型膠原和蛋白多糖等，對軟骨基質中含量最多的Ⅱ型膠原的降解起關鍵的作用［5］。故MMP-1與TIMP-1的表達變化反映RA關節軟骨細胞外基質Ⅱ型膠原代謝變化。本研究結果表明，在AA模型組大鼠的病變發展過程中，滑膜組織、軟骨中MMP-1、TIMP-1的表達呈逐漸升高趨勢，且MMP-1的表達升高幅度遠遠高于TIMP-1的表達，故MMP-1的表達升高可能是RA病理性發展的原因之一。滑膜組織、軟骨中MMP-1／TIMP-1的表達失衡導致Ⅱ型膠原結構破壞及蛋白多糖過度降解，使軟骨基質成分降解，軟骨細胞失去保護屏障，炎性因子更易于攻擊軟骨細胞，導致軟骨失去正常的彈性及變形能力，加重使關節軟骨功能惡化，進一步加重軟骨破壞［6］。本實驗中模型組大鼠左足較相應時間點的正常組繼發性足腫脹、足爪關節炎指數明顯，差異有統計學意義，說明AA大鼠模型建立。

目前RA治療上主要依賴激素及免疫抑制劑等，其毒副作用較大；而生物制劑的價格昂貴，患者依從性差。白藜蘆醇存在于21科、31屬的72種食用或藥用植物中，尤以葡萄、虎杖和花生含量高。體外試驗［7］表明白藜蘆醇通過抑制核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）活性，進而抑制白介素-1（interleukin-1，IL-1）β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）產生、阻滯細胞周期、阻斷疾病的發展；其抑制環氧合酶（cyclooxygenase，Cox-2）、抗氧化、抗血小板聚集的作用可改善病情和癥狀，對RA具有標本兼治的獨特藥理作用。田靜等［7］證實白藜蘆醇呈劑量依賴性阻滯RA成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）細胞周期、降低磷脂酰肌醇3（PI3K-Akt）信號通路Akt磷酸化水平，發揮抑制FLS增殖、誘導FLS凋亡作用，具有治療RA的潛在價值。本課題組也顯示白藜蘆醇能在體外通過磷酸化細胞外信號調節激酶（phospho-extracellular signal-regulated kinase，p-ERK）通路抑制滑膜細胞生長，從而治療AA大鼠關節炎癥狀［8］。但白藜蘆醇治療RA的整體動物實驗研究的報道較少，杜金烽等［9］研究發現，白藜蘆醇能夠通過降低實驗大鼠血清抗CⅡ抗體水平對膠原誘導的大鼠關節炎有抗炎作用。本實驗復制的大鼠AA模型，肉眼及鏡下觀察到滑膜組織充血、水腫、增厚，滑膜細胞呈增生狀態，并有明顯的炎細胞浸潤；軟骨表面有不同程度的糜爛、缺損，軟骨細胞排列紊亂，細胞減少，與RA的病理形態學變化相似，表明模型復制成功。本研究表明白藜蘆醇能明顯抑制AA大鼠繼發炎癥，對AA大鼠關節有很好的保護作用。免疫組化結果顯示AA大鼠軟骨細胞大量表達的MMP-1、TIMP-1雖增加，但相對于MMP-1表達甚少，呈現MMPs／TIMPs的失衡，不能抑制MMP-1對ECM的過度降解。關節軟骨屬于透明軟骨，其基質主要由蛋白多糖和膠原原纖維等組成，其特殊結構和生化特性使軟骨具有彈性、張力及吸收和分散負荷的能力。關節軟骨的正常結構和功能維持有賴于軟骨細胞和基質成分在形態與代謝方面的正常與穩定［10］。

本實驗中白藜蘆醇明顯改善了AA關節癥狀及病理變化，其機制可能與其抑制滑膜組織和軟骨基質的降解作用有關，本實驗為將白藜蘆醇進一步開發和利用成為治療RA的藥物提供一定的實驗依據，對將其研制成安全、高效、經濟、有自主知識產權的RA新型藥物具有一定潛在的應用前景。本實驗僅從一方面探討MMP-1及TIMP-1與AA的關系，MMPS家族中其他亞型間的相互作用在RA的發病中亦起著重要的作用，這些都有待于今后進一步研究。

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Effect of MMP-1，TIMP-1 of resveratrol on rats with adjuvant arthritis

An Mei1，2，Sun Heyan3，Lu Jinsen4，et al
（1Dept of Tissue Embryology，4Dept of Clinical Medicine，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Human Anatomy，Anhui Medical College，Hefei 230601；3Dept of Orthopedic，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the expression of matrix metalloproteinases 1（MMP-1）and tissue matrix metalloproteinases inhibitor-1（TIMP-1）of synovial tissues and articular cartilage in rats with adjuvant arthritis（AA），to explore whether there is a relation between pathogenesis of AA and expression of MMP-1 and TIMP-1.Methods60 SD rats were randomly divided into 2 groups：normal control group（n＝10）and model group（n＝50）.The model group was injected freund＇s complete adjuvant induced arthritis.When the right paw was induced after 12 days and secondary immune-inflammatory feet were swelled，the rats were randomly divided into 4 groups，and each group had 10 rats：model，resveratrol low dose group（5 mg／kg），resveratrol high dose group（15 mg／kg），positive control tripterygium wilfordii glycoside（TWG，100 mg／kg），qd×18 day；after inducing inflammatory paw，the expressions of MMP-1 and TIMP-1 in synovial tissue and articular cartilage were detected by immunohistoehemistry.MMP-1 and TIMP-1 protein content in synovial tissue was detected by Western blot.ResultsResveratrol could inhibit model group rats pathological damage，compared with the AA model group，synovial tissue expression of MMP-1 was significantly higher in resveratrol-treated groups（P＜0.05，P＜0.01），the expression of TIMP-1 was also higher（P＜0.05）.There was a correlation in the role of the anti-inflammation.ConclusionResveratrol inhibits the inflammation of AA rats and prevents the pathological changes of the joint degeneration，its mechanism is related to regulation of matrix metalloproteinases in synovial tissue of rats and the expression of articular cartilage.

adjuvant arthritis；resveratrol；matrix metalloproteinases 1；matrix metalloproteinases inhibitor-1；Western blot；rats

R-332

A

1000－1492（2014）06－0701－05

2014－02－17接收

國家自然科學基金（編號：81373421）；國家級大學生創新創業訓練計劃項目（編號：201310366007）；安徽省自然科學基金（編號：1208085MC53）

安徽醫科大學1組織胚胎學教研室、4臨床醫學系，合肥2300322安徽醫學高等專科學校解剖教研室，合肥 2306013安徽醫科大學第一附屬醫院骨科，合肥 230022

安 梅，女，講師，碩士研究生；陳曉宇，男，博士，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：cxyayd＠163.com孫和炎，男，副主任醫師，責任作者，E-mail：sunyu20055＠sohu.com