蛋白質組學在果實成熟衰老機理方面的研究進展

李 欣，畢 陽，王軍節，龔 迪

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

果實的成熟衰老是高度協調、不可逆轉的復雜過程，涉及大量基因表達和生理生化等代謝[1]，這些過程不僅受生長發育階段和激素水平的影響，還受采后處理和貯藏條件的調控[2-3]。成熟衰老作為果實發育的最后階段，直接影響著果實的采后壽命和品質[4]。

蛋白質組學是近年來發展起來的一項新技術，可系統地研究果實生理生化以及與成熟衰老相關的功能性蛋白或者基因的變化，動態描述蛋白水平的表達差異，并鑒定出與其具體變化相關的蛋白或基因，分析不同生長時期、不同環境條件對果實生命過程的影響，從蛋白質水平上揭示各種生理過程的分子機理，為果實成熟衰老機理的研究提供全新的技術方法[5-7]。因此，蛋白質組學的應用對于從更深層次揭示果實的成熟衰老及品質形成機制具有重要意義。本文綜述了蛋白質組學在躍變型和非躍變型果實成熟衰老機理方面的研究進展，并提出了存在的不足及今后的發展趨勢。

1 躍變型果實

1.1 番茄

作為模式植物，番茄被廣泛用于成熟衰老機理的研究。Rocco等[8]利用比較蛋白質組學研究了兩個當地品種在成熟過程中蛋白質的變化，鑒定出83個蛋白點，其中涉及氧化還原控制、防衛脅迫反應、碳代謝、能量生成及信號轉導等重要生理反應，該研究首次表征了番茄果實在成熟過程中的蛋白組變化圖譜。Faurobert等[9]利用雙向電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）分析了櫻桃番茄果皮在6個不同發育階段的蛋白質變化，并通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/MS）和液相色譜質譜聯用（liquid chromatogram-mass spectrometer，LC-MS）鑒定出90種蛋白質。結果表明，幼果中與氨基酸代謝和蛋白質合成的蛋白點主要在細胞分裂期表達，之后下調；在細胞膨大期，與光合作用和細胞壁形成的蛋白點暫時性增加；相反，涉及到碳化合物和糖代謝以及氧化過程的蛋白質卻在此過程中下調，而在成熟果實中其豐度達到最大，與脅迫響應和果實衰老相關蛋白點的變化規律也同上述結果一致，該研究從蛋白組水平上豐富了果實成熟衰老的分子基礎。Barsan等[10]研究了紅番茄果實中有色體的蛋白質組學，通過Western blotting分析鑒定出988個蛋白點，涉及到參與香氣物質合成的脂氧合酶途徑的所有蛋白、淀粉合成和降解的蛋白、葉綠素降解的蛋白、卡爾文循環和磷酸戊糖途徑的全套蛋白，但缺少葉綠素合成的蛋白以及關于類囊體轉運機制的蛋白，這些結果為研究番茄有色體的代謝特點以及解釋果實的成熟機理提供了新的思路。Konozy等[11]運用蛋白組學技術十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、LC-MS/MS）研究了3種成熟番茄果實蛋白質組，并比較了它們的質地特性，鑒定出25種細胞壁蛋白，分別參與了多糖、脂質、氧化還原等代謝，為揭示果實的成熟衰老提供了重要線索。

1.2 桃

Prinsi等[12]分析了兩個品種的桃在不同果肉硬度時期的差異蛋白表達情況，53個蛋白點在成熟過程中發生了顯著變化，其中39個用LC-ESI-MS/MS鑒定出來，這些蛋白質既參與了基礎代謝（糖類、有機酸、氨基酸）和乙烯合成，又涉及了次級代謝和脅迫反應。研究發現，1-氨基環丙烷-1-羧基氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase，ACO）在果實從呼吸躍變前期向躍變期轉化的過程中豐度變化較大，其他參與乙烯代謝的相關蛋白，如硫腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）合成酶和β-氰丙氨酸合成酶也被鑒定出來。同時，蔗糖合成酶和α-淀粉酶的豐度變化暗示了兩個品種的成熟桃果實在糖代謝活力方面存在差異性。另外，一些典型的活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除酶在兩個品種之間也呈現差異積累。Hu Hao等[13]分析了桃果實內果皮和中果皮在花后28～59 d的差異蛋白質，結果表明，68種蛋白質在此過程中差異表達，其中大多數參與了初級和次級代謝；內果皮中的大多數參與初級代謝的蛋白質表達量下調，但丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）豐度卻增加，而且，其表達模式與木質素含量的增加呈線性正相關，表明PDH在木質化作用中發揮著重要作用。同時數據顯示涉及木質素和黃酮類代謝的相關酶類在內果皮發育過程中的表達具有時空性，且這兩種途徑存在競爭性。此外，氧化脅迫蛋白只在內果皮中觀察到，推測其在激活木質化作用和后續程序性細胞死亡中發揮作用。Qin Guozheng等[14]利用2-DE結合Immunoblotting研究了桃果實衰老過程中線粒體蛋白的變化，結果顯示個別線粒體蛋白、三羧酸循環酶、抗氧化蛋白的氧化損傷與線粒體生物學功能的喪失密切相關，最終導致果實衰老。

1.3 蘋果

Guarino等[15]通過經典的蛋白質組學技術（2-DE、MALDI-TOF-MS和μLC-ESI-IT-MS/MS）分析了蘋果果肉中主要可溶性化合物，利用相關數據庫最終鑒定出44個蛋白點，涉及到28種蛋白質，分別參與了能量生成、成熟和脅迫響應等重要生理過程。Qin Guozheng等[16]研究了蘋果衰老過程中線粒體蛋白質組的動態變化，并深入分析了活性氧對衰老的影響，此研究表明ROS可能是通過改變一些線粒體蛋白的表達并使其生物學功能喪失來調控果實的成熟衰老。

1.4 香蕉

Toledo等[17]應用雙向熒光差異凝膠電泳（twodimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE）研究了香蕉果實在成熟過程中蛋白的變化，共鑒定出26個蛋白點，豐度最大的是幾丁質酶，熱激蛋白、異黃酮還原酶、果膠裂解酶、蘋果酸脫氫酶、淀粉磷酸化酶及乙烯合成相關酶也有所積累。此研究提供了關于香蕉果實成熟過程中與風味、質地、防衛、乙烯合成、表達調控、蛋白質折疊有關的蛋白質變化信息。

1.5 芒果

Andrade等[18]應用2D-DIGE對比了芒果果實在呼吸躍變前期和呼吸躍變時的蛋白質豐度變化，利用LC-MS/MS鑒定出47個差異蛋白點。結果顯示，與激素合成相關的蛋白質豐度下降，而與分解代謝和脅迫反應有關的蛋白質在成熟過程中呈積累趨勢。

1.6 番木瓜

Nogueira等[19]比較了番木瓜果實在呼吸躍變前期和呼吸躍變時的蛋白質組變化。運用質譜技術鑒定了37個顯著差異的蛋白點，其中27種蛋白質被分為六大類，分別為糖代謝、次級代謝、乙烯的合成與調控、能量代謝、脅迫反應、貯藏蛋白。

1.7 杏

Ambrosio等[20]利用1D和2D技術分離了杏果實3個不同成熟階段的蛋白質，在2D圖譜上106個蛋白點呈現差異性積累，進一步運用MALDI-TOF-PMF和nanoLC-ESILIT-MS/MS對其進行鑒定，結果表明，大部分蛋白質作為酶類涉及糖類和能量代謝、有機酸代謝、乙烯的生物合成、細胞壁重建、脅迫響應等生化過程，另外一些與果實的感官品質密切相關，該研究提供了杏果實成熟過程的初步相關信息。

2 非躍變型果實

2.1 葡萄

Negri等[21]利用LC-ESI-MS/MS鑒定出葡萄皮中的69個蛋白點，這些蛋白質參與了脅迫反應（38%）、糖酵解和糖異生（13%）、碳化合物和糖代謝（13%）、氨基酸代謝（10%）等生理過程。在不同的成熟時期，葡萄皮中的蛋白質呈現差異分布，涉及光合作用、糖代謝和脅迫反應的蛋白質在顏色變化初期過表達，而在顏色變化后期，參與花青素合成的蛋白質過表達，在采收期，關鍵的防衛反應蛋白質豐度上調。需要特別指出的是，發現幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶的豐度上調，與這些酶在成熟過程中的活性增加相一致[22]。Sarry等[23]提取了6個不同品種葡萄中果皮里的主要可溶性蛋白，在2D圖譜上發現了大約300個蛋白點，利用MALDI-MS鑒定出67種蛋白質，分別參與了能量代謝（34%）、防衛和脅迫響應（19%）、初級代謝（13%）等過程，2-DE分析發現，脫水蛋白、蔗糖酶以及病程相關蛋白在成熟果實中大量積累，同時觀察到乙醇脫氫酶和己糖轉運蛋白在6個品種中的表達存在顯著差異。Wang Wei等[24]運用蛋白質組學方法分析了β-1,3-葡聚糖酶在葡萄果實不同組織中的表達情況，結果表明，果皮中的β-1,3-葡聚糖酶豐度高于果肉中，說明其表達具有組織特異性，同時也暗示β-1,3-葡聚糖酶可能與葡萄果實的成熟有關。Zhang Jiangwei等[25]研究了葡萄原生質膜蛋白在成熟過程中的表達情況，鑒定出了62個蛋白點，包括ATP合成酶、GTP結合酶等，參與了轉運、代謝、信號轉導、蛋白質合成等反應。在果實成熟過程中，發現原生質膜蛋白總量逐漸下降，泛素水解蛋白和細胞骨架蛋白豐度上調，泛素結合酶E2-21豐度下調。Giribaldi等[26]的研究結果證明了在葡萄成熟過程中，大多數蛋白質與能量、代謝、蛋白質合成有關，少數與脅迫反應相關的蛋白質及多數與細胞結構相關的蛋白質進行了差異表達。

2.2 柑橘

Katz等[27]利用LC-MS/MS技術及已有的NCBI-nr和柑橘ESTs數據庫分析了柑橘蛋白質組，從代謝的角度系統研究了柑橘成熟過程中的蛋白質變化情況。Muccilli等[28]運用2-DE結合LC-MS/MS鑒定出了成熟甜橙果肉中差異表達的55種蛋白質，其中與糖代謝有關的蛋白質在Moro中過表達，而與脅迫反應相關的在Cadenera中過表達，而且證實了在Moro中參與次級代謝和氧化過程的蛋白質在花青素合成的過程中具有重要作用。Pan Zhiyong等[29]通過2-DE結合MALDI-TOF-TOF MS分析了突變體“Hong Anliu”甜橙及其野生型4個成熟階段果肉的蛋白質組變化，在鑒定出的74種差異表達的蛋白質中，大部分參與了脅迫響應，糖/能量代謝與調控及蛋白質命運、修飾與降解。尤其值得注意的是，在突變體中6種抗氧化酶的表達水平有所改變，分析其相對酶活發現突變體果實的抗氧化能力較強，暗示氧化脅迫對類胡蘿卜素的形成有調控作用。鐘鳳林[30]以琯溪蜜柚汁胞為材料，利用雙向電泳、質譜技術，對汁胞的不同發育階段進行了差異蛋白質組學分析，建立了適合琯溪蜜柚汁胞蛋白質組學研究的技術平臺，獲得與汁胞發育、成熟和衰老相關的差異蛋白質，共檢測到1037±60個蛋白質點，其中有100個蛋白質點在不同發育時期上調表達，217個蛋白質點下調表達，選取50個不同發育時期的汁胞差異蛋白質點進行質譜鑒定和生物信息學分析，根據蛋白質的功能可以把他們劃分為調控蛋白、轉錄因子、能量代謝、細胞骨架、防衛反應、代謝酶等，為揭示琯溪蜜柚汁胞在發育成熟過程中某些關鍵的生理活動提供了一定的理論依據。

2.3 草莓

Bianco等[31]通過多維液相色譜-串聯質譜、單向SDS-PAGE結合納升級液相色譜-串聯質譜鑒定了蛋白質，利用DIGE技術研究了草莓果實成熟過程中差異積累的蛋白質，其中大多數參與了能量和碳代謝、蛋白質合成與貯藏、蛋白質水解、脅迫反應等過程，并關聯了與果實品質相關的蛋白質表達。

2.4 荔枝

李開拓[32]以荔枝品種“烏葉”和“下番枝”果實為實驗材料，利用雙向電泳和質譜技術對荔枝果實不同成熟時期進行了差異蛋白質組學研究，獲得了與荔枝果實成熟衰老相關的差異蛋白。這些蛋白質參與了糖和能量代謝、蛋白質合成與代謝以及穩定、基因表達調控、抗氧化、氨基酸代謝、信號轉導等生理過程，該研究為揭示荔枝果實成熟過程中有關生理事件創造了良好的技術平臺。

表1 果實成熟衰老過程中差異表達蛋白質功能分類Table 1 Functional classification of differentially expressed proteins during fruit ripening and senescence

綜上所述，利用蛋白質組學技術鑒定出的果實成熟衰老過程中的相關蛋白質根據其生物學功能主要分為以下幾大類（表1）。其中，普遍涉及了基礎代謝、防衛脅迫反應和能量生成等過程，因而從蛋白質表達水平上揭示果實的成熟衰老機理提供了有力的依據。另外，線粒體是細胞內數量最多的細胞器，在能量產生以及細胞代謝中起主要作用，研究線粒體蛋白質氧化損傷將為活性氧調控果實成熟衰老的機制提供新的思路。

3 結 語

目前，蛋白質組學在果實成熟衰老研究中主要側重于鑒定差異表達的蛋白質，并依據其生物學功能進行分類，但對這些蛋白質在其參與的重要生理代謝過程中的變化規律及作用的深入研究相對較少。一些細胞器，如線粒體、葉綠體、細胞核等在果實成熟衰老過程中發揮著重要作用，但對其相關蛋白質組的研究也鮮見報道。由于果實組織的結構特殊，加之種類繁多，成熟衰老過程多樣，僅僅利用蛋白質組學技術難以全面揭示其成熟衰老機理。

因此，今后在運用蛋白質組學技術研究果實成熟衰老機理時，應在傳統2-DE的基礎上，著重利用非電泳分離技術如LC-MS/MS、同位素標記相對和絕對定量技術（isobarictags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）[33]、同位素標記親和標簽（isotope-coded affinity tag，ICAT）[34]及Immunoblotting等，并結合EST數據庫實現果實亞細胞蛋白質組學和定量蛋白質組學的研究。此外，蛋白質組學還需要與其他生物組學（轉錄組學[35]、代謝組學[36]）有機結合，才能深入了解關鍵蛋白質及編碼相關蛋白的基因在重要生理活動中的準確作用，更全面和系統地闡明果實成熟衰老的分子機理。

[1]PRASANNA V, PRABHA T N, THARANATHAN R N.Fruit ripening phenomena: an overview[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2007, 47(1): 1-19.

[2]PALMA J M, CORPAS F J, R O L A.Proteomics as an approach to the understanding of the molecular physiology of fruit development and ripening[J].Journal of Proteomics, 2011, 74(8): 1230-1243.

[3]BRADY C J.Fruit ripening[J].Annual Review of Plant Physiology,1987, 38: 155-178.

[4]田世平, 羅云波, 王貴禧.園藝產品采后生物學基礎[M].北京: 科學出版社, 2011: 418-443.

[5]PARK O K.Proteomic studies in plants[J].Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2004, 37(1): 133-138.

[6]JORRíN-NOVO J V, MALDONADO A M, ECHEVARRíAZOME?O S, et al.Plant proteomics update (2007—2008): secondgeneration proteomic techniques, an appropriate experimental design,and data analysis to ful fill MIAPE standards, increase plant proteome coverage and expand biological knowledge[J].Journal of Proteomics,2009, 72(3): 285-314.

[7]張麗, 羅海波, 姜麗, 等.果實成熟衰老過程中蛋白質組學研究進展[J].植物生理學報, 2011, 47(9): 861-871.

[8]ROCCO M, D’AMBROSIO C, ARENA S, et al.Proteomic analysis of tomato fruits from two ecotypes during ripening[J].Proteomics, 2006,6(13): 3781-3791.

[9]FAUROBERT M, MIHR C, BERTIN N, et al.Major proteome variations associated with cherry tomato pericarp development and ripening[J].Plant Physiology, 2007, 143(3): 1327-1346.

[10]BARSAN C, SANCHEZ-BEL P, ROMBALDI C, et al.Characteristics of the tomato chromoplast revealed by proteomic analysis[J].Journal of Experimental Botany, 2010, 61(9): 2413-2431.

[11]KONOZY E H E, ROGNIAUX H, CAUSSE M, et al.Proteomic analysis of tomato (Solanum lycopersicum) secretome[J].Journal of Plant Research, 2013, 126(2): 251-266.

[12]PRINSI B, NEGRI A S, FEDELI C, et al.Peach fruit ripening: a proteomic comparative analysis of the mesocarp of two cultivars with different flesh firmness at two ripening stages[J].Phytochemistry,2011, 72(10): 1251-1262.

[13]HU Hao, LIU Yong, SHI Guanglu, et al.Proteomic analysis of peach endocarp and mesocarp during early fruit development[J].Physiologia Plantarum, 2011, 142(4): 390-406.

[14]QIN Guozheng, MENG Xianghong, WANG Qing, et al.Oxidative damage of mitochondrial proteins contributes to fruit senescence: a redox proteomics analysis[J].Journal of Proteome Research, 2009,8(5): 2449-2462.

[15]GUARINO C, ARENA S, SIMONE L, et al.Proteomic analysis of the major soluble components in Annurca apple flesh[J].Molecular Nutrition & Food Research, 2007, 51(2): 255-262.

[16]QIN Guozheng, WANG Qing, LIU Jia, et al.Proteomic analysis of changes in mitochondrial protein expression during fruit senescence[J].Proteomics, 2009, 9(17): 4241-4253.

[17]TOLEDOA T T, NOGUEIRAA S B, CORDENUNSI B R, et al.Proteomic analysis of banana fruit reveals proteins that are differentially accumulated during ripening[J].Postharvest Biology and Technology,2012, 70: 51-58.

[18]ANDRADE J M, TOLEDO T T, NOGUEIRA S B, et al.2D-DIGE analysis of mango (Mangifera indicaL.) fruit reveals major proteomic changes associated with ripening[J].Journal of Proteomics, 2012,75(11): 3331-3341.

[19]NOGUEIRA S B, LABATE C A, GOZZO F C, et al.Proteomic analysis of papaya fruit ripening using 2DE-DIGE[J].Journal of Proteomics, 2012, 75(4): 1428-1439.

[20]AMBROSIO C D, ARENA S, ROCCO M, et al.Proteomic analysis of apricot fruit during ripening[J].Journal of Proteomics, 2013, 78(14): 39-57.

[21]NEGRI A S, PRINSI B, ROSSONI M, et al.Proteome changes in the skin of the grape cultivar Barbera among different stages of ripening[J].BMC Genomics, 2008, 9: 378-396.

[22]DEYTIEUX C, GENY L, LAPAILLERIE D, et al.Proteome analysis of grape skins during ripening[J].Journal of Experimental Botany,2007, 58(7): 1851-1862.

[23]SARRY J E, SOMMERER N, SAUVAGE F X, et al.Grape berry biochemistry revisited upon proteomic analysis of the mesocarp[J].Proteomics, 2004, 4(1): 201-215.

[24]WANG Wei, BIANCHI L, SCALI M, et al.Proteomic analysis ofβ-1,3-glucanase in grape berry tissues[J].Acta Physiol Plant, 2009,31(3): 597-604.

[25]ZHANG Jiangwei, MA Huiqin, FENG Jidong, et al.Grape berry plasma membrane proteome analysis and its differential expression during ripening[J].Journal of Experimental Botany, 2008, 59(11):2979-2990.

[26]GIRIBALDI M, PERUGINI I, SAUVAGE F X, et al.Analysis of protein changes during grape berry ripening by 2-DE and MALDITOF[J].Proteomics, 2007, 7(17): 3154-3170.

[27]KATZ E, FON M, LEE Y J, et al.The citrus fruit proteome: insights into citrus fruit metabolism[J].Planta, 2007, 226(4): 989-1005.

[28]MUCCILLIA V, LICCIARDELLO C, FONTANINI D, et al.Proteome analysis ofCitrus sinensisL.(Osbeck) flesh at ripening time[J].Journal of Proteomics, 2009, 73(1): 134-152.

[29]PAN Zhiyong, LIU Qing, YUN Ze, et al.Comparative proteomics of a lycopene-accumulating mutant reveals the important role of oxidative stress on carotenogenesis in sweet orange (Citrus sinensis[L.]osbeck)[J].Proteomics, 2009, 9(24): 5455-5470.

[30]鐘鳳林.琯溪蜜柚汁胞發育過程的差異蛋白質組學研究[D].福州:福建農林大學, 2009.

[31]BIANCO L, LOPEZ L, SCALONE A G, et al.Strawberry proteome characterization and its regulation during fruit ripening and in different genotypes[J].Journal of Proteomics, 2009, 72(4): 586-607.

[32]李開拓.荔枝果實成熟過程中的差異蛋白質組學研究[D].福州: 福建農林大學, 2011.

[33]WIESE S, REIDEGELD K A, MEYER H E, et al.Protein labeling by iTRAQ: a new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research[J].Proteomics, 2007, 7(3): 340-350.

[34]SHIIO Y, AEBERSOLD R.Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry[J].Nature Protocols,2006, 1: 139-145.

[35]HEGDE P S, WHITE I R, DEBOUCK C.Interplay of transcriptomics and proteomics[J].Current Opinion in Biotechnology, 2003, 14(6):647-651.

[36]HOLLYWOOD K, BRISON D R, GOODACRE R.Metabolomics:current technologies and future trends[J].Proteomics, 2006, 6(17):4716-4723.