魚骨粉粒徑對(duì)魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物中鈣生物利用率的影響

謝雯雯，尹 濤，張 晉，劉 茹，趙思明，熊善柏

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.國(guó)家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北 武漢 430070）

鈣是人體中含量最多的礦物質(zhì)元素，其代謝平衡對(duì)維持人體健康起著至關(guān)重要的作用[1]。我國(guó)的膳食營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)以谷類為主，導(dǎo)致我國(guó)居民普遍缺鈣[2]，因此攝食補(bǔ)鈣制劑是預(yù)防和治療鈣缺乏、骨質(zhì)疏松的主要手段。目前主要有無機(jī)和有機(jī)鈣鹽類、生物骨鈣類等兩大類補(bǔ)鈣制劑，其中無機(jī)、有機(jī)鈣鹽類包括碳酸鈣、葡萄糖酸鈣、乳酸鈣等，這類鈣制劑存在著水溶性不高、吸收率較低、且對(duì)腸胃有一定的刺激性的缺點(diǎn)，在第二類補(bǔ)鈣產(chǎn)品中，有天然生物骨鈣（魚骨鈣、牦牛骨鈣）和螯合鈣制劑（氨基酸螯合鈣）[3-4]。生物骨鈣中，有研究證明微細(xì)化魚骨粉具有較高的鈣吸收率和鈣存留率[5]，且顯著高于相應(yīng)劑量的碳酸鈣[6]。

近年來，我國(guó)淡水魚加工業(yè)發(fā)展迅速，其中魚糜制品因其具有高蛋白、低脂肪、品種多樣等特點(diǎn)深受消費(fèi)者歡迎。白鰱是魚糜制品主要的原料之一，其采肉率一般只有25%～30%，采肉剩余的魚骨中含有豐富的鈣、磷等礦物質(zhì)，且其鈣磷比接近人體最佳吸收比例，是一種良好的天然鈣源[7-8]。已有報(bào)道證明，鈣制劑的粒徑對(duì)其鈣吸收有明顯影響[9-10]，但魚骨粉粒徑對(duì)其鈣吸收率影響的研究未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以采肉剩余的鰱魚中骨為原料，通過酶解制成不同粒徑的魚骨粉，分別與魚蛋白肽混合制備成魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物，探究魚骨粉粒徑對(duì)魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物中鈣的吸收利用率的影響，為利用魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物開發(fā)制備新型補(bǔ)鈣產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚購(gòu)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)集貿(mào)市場(chǎng)。

魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物，將酶解制得的魚骨粉烘干，經(jīng)不同程度粉碎后過篩，制得小粒徑（d≤74 μm）、中粒徑（d=165～74 μm）和大粒徑（d=833～165 μm）3個(gè)粒徑等級(jí)的魚骨粉。酶解制得的酶解液經(jīng)濃縮、冷凍干燥并粉碎后制得魚蛋白酶解物（其水解度為25.80%，平均肽鏈長(zhǎng)度為2.25個(gè)氨基酸），將不同粒徑的魚骨粉分別和魚蛋白酶解物按一定比例混合，制得含有不同粒徑魚骨粉的魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物（其蛋白質(zhì)含量分別為（28.33±1.07）%、（29.00±0.72）%、（29.87±0.86）%；鈣含量分別為：（25.48±0.06）%、（22.67±0.09）%、（21.75±0.20）%；磷含量分別為（9.57±0.03）%、（9.74±0.03）%、（9.90±0.00）%）。

木瓜蛋白酶（分析純） 美國(guó)Sigma公司；實(shí)驗(yàn)中其他化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AA-6300C原子吸收儀 日本島津公司；TA.XT.plus質(zhì)構(gòu)分析儀 北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司；BS-210型分析天平 德國(guó)Sartorius公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；722型可見分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；游標(biāo)卡尺（150mm×0.02mm） 上海量具刃具制造廠；Discovery A（S/N86171）骨密度儀 美國(guó)Hologic公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物飼料的配制

動(dòng)物飼料配方參照AIN-93標(biāo)準(zhǔn)配制[11]，小粒徑組、中粒徑組、大粒徑組飼料的鈣源分別為添加了小粒徑、中粒徑、大粒徑魚骨粉的魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物。各組飼料配方除鈣源不同外，其他成分均保持一致。動(dòng)物飼料的配方均為食用級(jí)物質(zhì)，均由江蘇特洛菲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料高科技平臺(tái)加工制作。小粒徑、中粒徑、大粒徑組大鼠飼料及碳酸鈣對(duì)照組、低鈣對(duì)照組大鼠飼料中鈣的含量分別為（0.68±0.02）%、（0.67±0.04）%、（0.71±0.03）%、（0.68±0.04）%、（0.23±0.00）%。AIN-93配方中，蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪酸、礦物質(zhì)、維生素含量分別為20.0%、64.0%、7.0%、3.5%、1.0%，具體成分見表1。

表1 AIN-93配方標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The AIN-93 formula standard

1.3.2 動(dòng)物的分組和飼養(yǎng)

4周齡的Wistar雄性大鼠40只（購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（鄂）2008-0005），隨機(jī)分為5組[12]，即小粒徑組、中粒徑組、大粒徑組、碳酸鈣對(duì)照組和低鈣對(duì)照組（即空白對(duì)照組），每組8只，在武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)（該中心所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施和環(huán)境條件符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)），自由進(jìn)食、飲水，定時(shí)更換墊料，每周稱量體質(zhì)量，代謝期收集大鼠糞便和尿液，記錄攝食量，代謝期結(jié)束后采用頸椎脫臼處死法處死大鼠，解剖觀察大鼠內(nèi)臟，收集雙側(cè)股骨。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持室內(nèi)環(huán)境溫度為18～29℃，日溫差≤3℃，相對(duì)濕度達(dá)40%～70%[13]。

1.3.3 動(dòng)物骨礦物鹽含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，取大鼠左側(cè)股骨，剔除骨上軟組織，采用高溫灼燒稱質(zhì)量法測(cè)骨礦物鹽含量。

1.3.4 動(dòng)物骨密度的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，分離其右側(cè)股骨，剔除骨上軟組織，用骨密度儀測(cè)其骨密度[2]。

1.3.5 動(dòng)物骨長(zhǎng)度的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，取大鼠左側(cè)股骨，剔除骨上軟組織，用游標(biāo)卡尺直接量取股骨長(zhǎng)度。

1.3.6 鈣含量的測(cè)定

采用原子吸收法，參照參考文獻(xiàn)[14]。

1.3.7 磷含量的測(cè)定

采用分光光度法，參照參考文獻(xiàn)[15]。

1.3.8 動(dòng)物鈣表觀吸收率的測(cè)定

測(cè)定代謝期期間大鼠的鈣攝入量X1，糞便中含鈣量X2，按式（1）計(jì)算鈣表觀吸收率[2]。

1.3.9 動(dòng)物鈣存留率的測(cè)定

測(cè)定代謝期期間大鼠的鈣攝入量X1、糞便中含鈣量X2、尿液中鈣含量X3，按式（2）計(jì)算鈣存留率[16]。

1.3.10 動(dòng)物骨生物力學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后立即取出試件，剔除骨上的軟組織，將紗布用生理鹽水浸透后，包裹在試件上，放入塑料袋中存放在－20℃的冰箱中，實(shí)驗(yàn)時(shí)將其自然解凍。實(shí)驗(yàn)時(shí)參數(shù)設(shè)置為：最大荷載20 kg；跨距15 cm；加載速率5 mm/min，加載時(shí)，注意試件橫截面短軸方向與加載力方向保持一致，記錄載荷-變形曲線，讀出實(shí)驗(yàn)試件的結(jié)構(gòu)力學(xué)指標(biāo)（最大載荷、最大撓度、彈性載荷、彈性撓度、韌性）。

用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠股骨空心橢圓的外長(zhǎng)軸B，空心橢圓的內(nèi)長(zhǎng)軸b、空心橢圓的外短軸H、空心橢圓的內(nèi)短軸h。試件長(zhǎng)軸壁厚、短軸壁厚、骨皮質(zhì)面積[17]計(jì)算分別見式（3）～（5），橫截面對(duì)其形心軸的慣性矩、最大應(yīng)力、彈性應(yīng)力、能量吸收計(jì)算分別見式（6）～（9）。

測(cè)量支座間的距離L，讀出曲線線性范圍內(nèi)相應(yīng)點(diǎn)的載荷P和跨中撓度f(wàn)，按式（10）計(jì)算試件的彈性模量[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取其平均值，采用Microsoft Excel、SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠體質(zhì)量的變化

圖1 實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠體質(zhì)量變化曲線Fig.1 Changes in body weight of rats during the experiment

圖2 實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)總值Fig.2 Gross weight gain of rats during the experiment

實(shí)驗(yàn)期間，各組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況良好，活動(dòng)正常，飲食穩(wěn)定。每周記錄大鼠的體質(zhì)量，繪得大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)曲線如圖1所示。各組大鼠在第1～10生長(zhǎng)周期間體質(zhì)量均呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)，第11生長(zhǎng)周后大鼠被移入代謝籠進(jìn)行代謝實(shí)驗(yàn)，新的環(huán)境對(duì)大部分大鼠食欲造成一定的影響，使其攝食量減小，體質(zhì)量降低，因此除低鈣對(duì)照組大鼠體質(zhì)量生長(zhǎng)正常外，其他4組大鼠均出現(xiàn)體質(zhì)量輕微下降的現(xiàn)象，代謝期結(jié)束后，大鼠被移回飼養(yǎng)籠，體質(zhì)量增長(zhǎng)恢復(fù)正常。經(jīng)計(jì)算，得出實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)總值如圖2所示，低鈣對(duì)照組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)總值最大（346.69±41.15）g，中粒徑組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)總值最?。?18.44±34.66）g，但5組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)總值之間不存在顯著性差異，說明魚骨粉的粒徑、鈣制劑的種類和劑量對(duì)其能量物質(zhì)的吸收代謝沒有顯著性影響。

2.2 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠內(nèi)臟質(zhì)量的差異

大鼠生長(zhǎng)及代謝實(shí)驗(yàn)進(jìn)行完后，采用斷頸的方法處死大鼠，解剖大鼠，觀察大鼠內(nèi)臟，并分別記錄大鼠的肝、脾、腎的質(zhì)量，求得大鼠肝、脾、腎與處死前大鼠體質(zhì)量的比值，結(jié)果見表2。

表2 不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物對(duì)大鼠肝體比、脾體比、腎體比的影響（ ±s,n=8）Table 2 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on liver index,spleen index, kidney index of rats ( ±s,n=8)

表2 不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物對(duì)大鼠肝體比、脾體比、腎體比的影響（ ±s,n=8）Table 2 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on liver index,spleen index, kidney index of rats ( ±s,n=8)

注：同列數(shù)據(jù)上標(biāo)字母不同，表示差異顯著（P＜0.05）；字母相同，表示差異不顯著。下同。

組別 肝體比/% 脾體比/% 腎體比/%小粒徑組 4.96±0.18A 0.17±0.01A 1.40±0.05A中粒徑組 4.97±0.16A 0.19±0.02A 1.37±0.16A大粒徑組 4.94±0.14A 0.19±0.03A 1.43±0.18A碳酸鈣對(duì)照組 5.07±0.05A 0.20±0.04A 1.34±0.05A低鈣對(duì)照組 5.01±0.05A 0.22±0.03A 1.46±0.12A

由表2可知，各組大鼠的肝體比、脾體比、腎體比之間均無顯著性差異（P＞0.05），且大鼠解剖后觀察，未見肝臟、脾、腎臟、肺臟、心臟等器官出現(xiàn)異常，說明各組大鼠均生長(zhǎng)正常，未發(fā)生重要器官病變或疾病感染，實(shí)驗(yàn)期間采集的所有數(shù)據(jù)均科學(xué)有效。

2.3 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠鈣表觀吸收率、鈣存留率的差異

大鼠代謝期間，按時(shí)記錄每只大鼠的攝食量，收集每只大鼠的糞便和尿液，測(cè)定各組大鼠的飼料、糞便和尿液中的鈣含量，計(jì)算出各組大鼠的鈣表觀吸收率、鈣存留率，結(jié)果見表3。

表3 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠鈣表觀吸收率、鈣存留率的差異（ ±s,n=8）Table 3 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on calcium apparent absorption rate and calcium retention rate of rats ( ±s,n=8)

表3 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠鈣表觀吸收率、鈣存留率的差異（ ±s,n=8）Table 3 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on calcium apparent absorption rate and calcium retention rate of rats ( ±s,n=8)

組別 鈣表觀吸收率/% 鈣存留率/%小粒徑組 47.84±3.90A 44.94±3.01BA中粒徑組 41.33±0.96B 39.75±3.66BC大粒徑組 37.89±2.05BC 37.16±3.07DC碳酸鈣對(duì)照組 31.92±3.22B 31.78±5.99D低鈣對(duì)照組 50.86±9.00A 50.24±9.29A

由表3可知，在3個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間，大鼠的鈣表觀吸收率隨著魚骨粉粒徑的減小呈顯著增大趨勢(shì)，說明魚骨粉粒徑對(duì)魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物中鈣的吸收有一定的影響，粒徑減小增大了與消化液的接觸面積，進(jìn)而提高了大鼠對(duì)其的吸收利用率。經(jīng)腸道吸收的鈣進(jìn)入血液循環(huán)后，大部分會(huì)沉積在骨骼中，當(dāng)血液中鈣濃度降低時(shí)，骨骼中的鈣就會(huì)釋放出來維持機(jī)體鈣平衡[20]，受試大鼠血液中的鈣在實(shí)驗(yàn)期間保持平衡狀態(tài)，因此3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的鈣存留率變化趨勢(shì)同鈣表觀吸收率一致。魚骨中鈣的主要存在形式為羥基磷灰石晶體（Ca10(PO4)6(OH)2）和無定型磷酸氫鈣（CaHPO4），由表3可知，小粒徑組大鼠的鈣表觀吸收率和鈣存留率均顯著高于碳酸鈣對(duì)照組，且小粒徑組大鼠飼料和碳酸鈣對(duì)照組飼料的鈣含量沒有顯著性差異（分別為（0.68±0.02）%、（0.68±0.04）%），鈣磷比均接近2∶1，說明該粒徑范圍魚骨粉中的羥基磷灰石晶體和無定型磷酸氫鈣經(jīng)酶解后其吸收利用率優(yōu)于同劑量的碳酸鈣。機(jī)體對(duì)鈣的吸收具有適應(yīng)性，當(dāng)鈣攝入量過多時(shí)，機(jī)體對(duì)鈣的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程將會(huì)達(dá)到飽和，此時(shí)鈣主要以被動(dòng)擴(kuò)散過程吸收，鈣的吸收率降低，當(dāng)鈣攝入量較少時(shí)，機(jī)體主要以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程完成對(duì)鈣的吸收，其鈣吸收率增高[21]。低鈣對(duì)照組大鼠的鈣表觀吸收率，鈣存留率均顯著高于其他4組，這可能是由于飼料中的鈣含量較低，機(jī)體對(duì)鈣的攝入量長(zhǎng)期不足，機(jī)體對(duì)鈣的吸收主要以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程為主，導(dǎo)致對(duì)鈣的吸收也會(huì)顯著增加。

2.4 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨理化性質(zhì)的差異

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠處死，取出大鼠右側(cè)股骨，去除其結(jié)締組織后測(cè)各組大鼠股骨的濕骨質(zhì)量、干骨質(zhì)量、骨密度、礦物鹽含量、骨鈣含量和骨磷含量，結(jié)果見表4。

表4 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨理化性質(zhì)的差異（ ±s,n=8）Table 4 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on the physical and chemical properties of the rat femur ( ±s,n=8)

表4 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨理化性質(zhì)的差異（ ±s,n=8）Table 4 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on the physical and chemical properties of the rat femur ( ±s,n=8)

組別 濕骨質(zhì)量/g干骨質(zhì)量/g骨密度/（g/cm2）礦物鹽含量/% 骨鈣含量/% 骨磷含量/%小粒徑組 1.04±0.11A0.67±0.08A 0.28±0.02A 65.62±0.64A24.18±0.01A0.97±0.00A中粒徑組 1.05±0.12A0.69±0.08A 0.26±0.01BA 64.28±0.85B23.93±0.01A0.81±0.00A大粒徑組 1.01±0.06A0.67±0.04A 0.26±0.00BA 64.17±0.80B21.21±0.01B0.81±0.00A碳酸鈣對(duì)照組1.03±0.07A0.66±0.05A 0.28±0.01A 64.31±0.17B23.39±0.02A0.87±0.00A低鈣對(duì)照組 1.05±0.03A0.66±0.03A 0.25±0.02B 62.32±1.27C17.84±0.01C0.87±0.00A

骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育過程表現(xiàn)為一定程度的骨量增加或保持骨量[22]，由表4可知，各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間濕骨質(zhì)量、干骨質(zhì)量都不存在顯著性差異，說明各組大鼠骨骼發(fā)育正常。骨密度和骨礦物鹽含量的測(cè)量是評(píng)價(jià)骨質(zhì)量的最好方法，間接用于評(píng)價(jià)鈣的營(yíng)養(yǎng)狀況[23]，低鈣對(duì)照組大鼠股骨骨密度、骨礦物鹽含量和骨鈣含量均顯著低于其他4組，說明魚骨粉和碳酸鈣中的鈣均有較好的沉積效果，有利于骨密度的增加。隨著魚骨粉粒徑的減小，大鼠股骨的骨密度、骨礦物鹽含量和骨鈣含量均增大，其中大粒徑組大鼠和中粒徑組大鼠股骨的骨密度和骨礦鹽含量差異沒有顯著性，中粒徑組大鼠和小粒徑組大鼠股骨的骨鈣含量差異沒有顯著性。小粒徑組大鼠與碳酸鈣對(duì)照組大鼠股骨的骨密度和骨鈣含量同處于最高水平，說明該粒徑范圍內(nèi)的魚骨粉和碳酸鈣中鈣的沉積效果相同，對(duì)應(yīng)大鼠的骨營(yíng)養(yǎng)情況均較好。各組大鼠股骨磷含量沒有顯著性差異，說明魚骨粉的粒徑，鈣源的種類以及鈣的攝入量對(duì)大鼠股骨磷含量的影響不顯著。

2.5 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨力學(xué)性質(zhì)的差異

表5 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨結(jié)構(gòu)的差異（ ±s,n=8）Table 5 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on the structure of the rat femur ( ±s,n=8)

表5 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨結(jié)構(gòu)的差異（ ±s,n=8）Table 5 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on the structure of the rat femur ( ±s,n=8)

組別 長(zhǎng)軸壁厚/mm 短軸壁厚/mm 骨皮質(zhì)面積/mm2小粒徑組 1.12±0.08A 0.78±0.08A 5.52±0.44A中粒徑組 0.81±0.08B 0.66±0.08BA 4.89±0.43BA大粒徑組 0.72±0.05B 0.63±0.05B 5.17±0.4BA碳酸鈣對(duì)照組 1.03±0.12A 0.76±0.12BA 4.97±1.86BA低鈣對(duì)照組 0.82±0.07B 0.63±0.07B 4.38±0.71B

骨標(biāo)本的結(jié)構(gòu)力學(xué)性質(zhì)與其形狀大小有關(guān)[17]，皮質(zhì)骨越薄，骨組織總量越小，越容易發(fā)生骨質(zhì)疏松癥或骨折[24]，因此實(shí)驗(yàn)樣本的長(zhǎng)、短軸厚度及骨皮質(zhì)面積可以反映樣品的強(qiáng)度和剛度。由表5可知，隨著魚骨粉粒徑的減小，大鼠股骨的長(zhǎng)、短軸壁厚均呈上升趨勢(shì)，小粒徑組大鼠股骨的長(zhǎng)、短軸壁厚，骨皮質(zhì)面積均高于其他粒徑組和碳酸鈣對(duì)照組、低鈣對(duì)照組，說明該粒徑范圍內(nèi)的魚骨粉更有利于大鼠股骨的生長(zhǎng)發(fā)育，骨皮質(zhì)厚度和骨皮質(zhì)面積的增加，使大鼠股骨強(qiáng)度和剛度較好，發(fā)生骨折的概率相對(duì)較小。

表6 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)性質(zhì)的差異（±s,n=8）Table 6 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on the structural mechanical properties of the rat femur (±s,n=8)

表6 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)性質(zhì)的差異（±s,n=8）Table 6 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on the structural mechanical properties of the rat femur (±s,n=8)

組別 最大載荷/kg 最大撓度/mm 能量吸收/（kg·mm） 彈性載荷/kg 彈性撓度/mm小粒徑組 15.33±0.65A 1.58±0.10A 7.52±0.48A 9.48±6.33A 1.19±0.03A中粒徑組 11.05±0.62B 1.39±0.06B 4.71±0.33B 9.57±0.53B 0.99±0.07B大粒徑組 13.18±2.55BA 1.44±0.05BA 4.15±0.48CB 9.02±0.84CB 0.92±0.04CB碳酸鈣對(duì)照組 11.48±1.16B 1.42±0.18BA 3.78±0.31C 8.76±0.67CB 0.86±0.01C低鈣對(duì)照組 10.98±0.64B 1.40±0.04B 3.62±0.4C 8.38±0.36C 0.86±0.06C

由表6可知，小、中、大粒徑組大鼠其股骨最大載荷和最大撓度隨著魚骨粉粒徑的減小雖存在明顯差異，但并未呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，能量吸收隨著魚骨粉粒徑的減小，對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組大鼠股骨的能量吸收呈顯著上升趨勢(shì)，其中小粒徑組大鼠股骨的最大載荷、最大撓度和能量吸收均顯著高于其他粒徑組，以及碳酸鈣對(duì)照組和最低水平的低鈣對(duì)照組，說明小粒徑組大鼠股骨的骨骼力學(xué)強(qiáng)度最大，發(fā)生骨折的幾率相對(duì)最低。低鈣對(duì)照組大鼠由于長(zhǎng)期缺鈣，股骨結(jié)構(gòu)疏松，致使股骨抗壓能力減小，容易發(fā)生骨折。

隨著魚骨粉粒徑的減小，對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組大鼠股骨彈性撓度呈顯著上升趨勢(shì)，說明魚骨粉的粒徑對(duì)大鼠股骨彈力性質(zhì)有一定影響，小粒徑魚骨粉對(duì)增強(qiáng)大鼠股骨彈力性質(zhì)的效果最佳，且優(yōu)于碳酸鈣對(duì)照組，因此小粒徑組大鼠的股骨在外力負(fù)荷作用下不易發(fā)生塑性變形，產(chǎn)生不可逆損傷的幾率也相對(duì)較小[23]。在所有受試大鼠中，低鈣對(duì)照組大鼠股骨的彈性載荷和彈性撓度均最低，說明魚骨粉和碳酸鈣對(duì)大鼠股骨彈力性質(zhì)都有增強(qiáng)作用，其中魚骨粉的效果更佳。

表7 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨材料力學(xué)性質(zhì)的差異（ ±s,n=8）Table 7 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on the material mechanical properties of the rat femur ( ±s,n=8)

表7 飼喂不同粒徑魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物的大鼠股骨材料力學(xué)性質(zhì)的差異（ ±s,n=8）Table 7 Effects of feeding mixtures of fish protein hydrolysate and hydrolyzed fish bone powders with different particle sizes on the material mechanical properties of the rat femur ( ±s,n=8)

組別 骨截面慣性矩/mm4 最大應(yīng)力/（kg/mm2）彈性應(yīng)力/（kg/mm2）彈性模量/（kg/mm2）韌性/（g/mm）小粒徑組 7.48±0.44A 12.35±0.79BA 10.17±4.87A 98.08±4.87B 8.25±1.41A中粒徑組 5.53±0.43B 11.63±1.20B 10.06±19.39A124.98±19.39BA 7.99±0.27A大粒徑組 4.91±0.40B 15.13±2.62A 10.42±18.13A141.55±18.13A 8.66±1.28A碳酸鈣對(duì)照組 6.29±1.86BA 11.16±2.92B 8.45±35.96A120.97±35.96BA10.06±1.87A低鈣對(duì)照組 5.57±0.71B 11.62±0.91B 8.89±15.19A124.31±15.19BA 8.12±0.59A

由表7可知，隨著魚骨粉粒徑的減小，大鼠股骨的骨截面慣性矩呈上升趨勢(shì)，說明魚骨粉的粒徑對(duì)大鼠股骨骨量圍繞骨中軸的分布狀態(tài)有顯著影響，魚骨粉粒徑越小，對(duì)應(yīng)受試大鼠股骨骨結(jié)構(gòu)分布離中心越遠(yuǎn)，骨結(jié)構(gòu)力學(xué)性能越優(yōu)[23-25]。彈性模量隨魚骨粉粒徑減小呈下降趨勢(shì)，即魚骨粉粒徑越小，對(duì)應(yīng)受試大鼠股骨對(duì)變形的阻力越小。魚骨粉的粒徑對(duì)大鼠股骨無機(jī)鹽質(zhì)量的影響沒有一定規(guī)律，因此對(duì)應(yīng)受試大鼠股骨的最大應(yīng)力的變化未呈現(xiàn)一定規(guī)律。5組大鼠間股骨的彈性應(yīng)力及韌性均無顯著性差異，表明魚骨粉的粒徑，鈣源的種類以及鈣的攝入量對(duì)受試大鼠股骨有機(jī)相質(zhì)量沒有顯著性影響[24]。小粒徑組大鼠股骨的骨截面慣性矩、最大應(yīng)力顯著大于碳酸鈣對(duì)照組，表明該粒徑范圍內(nèi)的魚骨粉對(duì)受試大鼠股骨無機(jī)相的形成和骨量分布的優(yōu)化優(yōu)于碳酸鈣。

3 討 論

我國(guó)市場(chǎng)上的補(bǔ)鈣產(chǎn)品種類繁多，近幾年來，鈣制劑在品種、處方組成、劑型及鈣鹽合成方面均有很大的發(fā)展，有學(xué)者以Wistar大鼠為模型，研究了市場(chǎng)上具有代表性的碳酸鈣制劑和氨基酸螯合鈣制劑的吸收率和骨骼效應(yīng)[2]，發(fā)現(xiàn)在同等水平鈣攝入量的情況下，氨基酸螯合鈣組的鈣吸收率達(dá)到了65.80%，顯著高于對(duì)應(yīng)劑量碳酸鈣組的49.43%（P＜0.05），這可能是由于氨基酸螯合鈣屬于復(fù)合補(bǔ)鈣產(chǎn)品，其中的VD含量（200 IU/g）高于碳酸鈣（156 IU/g），促進(jìn)了鈣的主動(dòng)吸收，氨基酸螯合鈣中的多種氨基酸，促進(jìn)了鈣的被動(dòng)吸收所致。也有學(xué)者研究了淡水魚骨粉的補(bǔ)鈣效果，結(jié)果表明淡水魚骨粉具有較高的鈣吸收率（63.42%）和鈣存留率（60.70%），且通過臨床實(shí)驗(yàn)證明其糾正缺鈣的效果優(yōu)于一般鈣劑[5]。王曉峰等[26]研究比較了納米螯合鈣、蘋果酸枸櫞酸鈣、L-天冬氨酸鈣、牦牛骨鈣、牛骨鈣、珊瑚鈣、魚骨鈣、碳酸鈣共8種鈣劑對(duì)大鼠鈣吸收率的影響，結(jié)果表明，8種飼料鈣水平相同的鈣劑，其鈣吸收率與鈣儲(chǔ)留率并無顯著性差異（P＞0.05），但均顯著高于低鈣組（P＜0.05），說明元素鈣在體內(nèi)的吸收率受不同鈣劑的物理性質(zhì)和化學(xué)形式的影響不大。

合理選擇鈣制劑，需要綜合考慮鈣制劑的鈣含量、吸收率、安全性及性價(jià)比等因素。盡管市場(chǎng)上的補(bǔ)鈣產(chǎn)品的種類繁多，但碳酸鈣仍然是目前應(yīng)用最廣的補(bǔ)鈣制劑，新型補(bǔ)鈣產(chǎn)品氨基酸螯合鈣也逐漸受到消費(fèi)者的歡迎。本實(shí)驗(yàn)制備的魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物，其鈣含量為23.30%左右，低于碳酸鈣（40.8%）[26]，與市售的樂力氨基酸螯合鈣含量相當(dāng)（23.25%）；蛋白質(zhì)含量為29.07%左右，顯著高于碳酸鈣和樂力氨基酸螯合鈣（14.00%）；鈣表觀吸收率為47.84%左右，高于碳酸鈣（31.92%），低于樂力氨基酸螯合鈣（50.40%）[7]。魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物是經(jīng)酶解、濃縮、干燥和物理粉碎獲得，魚骨上剩余的蛋白質(zhì)被水解成小分子質(zhì)量肽和氨基酸，有利于機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的吸收利用，且水解產(chǎn)物中含有一定量的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，具有降血壓的活性[27]。相比與氨基酸螯合鈣的制備工藝，魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物省去了氨基酸溶解、加金屬鹽、螯合反應(yīng)、有機(jī)溶劑沉淀產(chǎn)物、分離等工序[28]，反應(yīng)條件易控制，工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高，產(chǎn)物安全。本實(shí)驗(yàn)證明了魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物鈣吸收利用率隨魚骨粉粒徑減小而增大的規(guī)律，在工業(yè)化生產(chǎn)中可考慮進(jìn)一步將魚骨粉進(jìn)行納米化，獲得粒徑更小的魚骨粉，用以制備粉劑或者片劑的補(bǔ)鈣產(chǎn)品。

4 結(jié) 論

魚骨粉的粒徑對(duì)大鼠的體質(zhì)量、肝體比、脾體比、腎體比無顯著影響（P＞0.05），對(duì)魚骨粉-魚蛋白肽混合鈣的鈣吸收利用率有顯著影響（P＜0.05）。隨著魚骨粉粒徑的減小，對(duì)應(yīng)受試大鼠的鈣表觀吸收率、鈣存留率、骨密度、骨礦物鹽含量、骨皮質(zhì)面積、股骨能量吸收等均呈顯著增大的趨勢(shì)，在添加了大、中、小3種粒徑魚骨粉的魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物中，添加粒徑≤74 μm魚骨粉的魚骨粉-魚蛋白酶解物混合物各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)均顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組和碳酸鈣對(duì)照組及低鈣對(duì)照組，其鈣表觀吸收率為（47.84±3.90）%，鈣存留率為（44.94±3.01）%，骨鈣含量為（24.18±0.01）%，能量吸收為（7.52±0.48）kg·mm，其鈣生物利用率最高。

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