手性藥物對映體分離檢測的研究式開放性實驗*

謝天堯 劉丹 賴瑢 戴宗 陳六平 巢暉

(中山大學化學與化學工程學院 廣東廣州510275)

手性藥物在藥物中占很大的比例，其在生物體內的吸收、分布和代謝均體現出立體選擇性，不同對映體往往顯示出不同的藥理學和毒理學特性［1］。由于對映異構體除旋光性不同外，在非手性環境中的物理化學性質完全相同，用一般的方法難以分離，因此手性藥物對映體的分離檢測是分析化學研究的熱點和難點之一［2］。目前，手性藥物對映體的分離檢測一般采用高效液相色譜(HPLC)。但由于HPLC存在手性色譜柱價格昂貴，色譜柱難沖洗、易損壞，溶劑消耗量大和維護成本較高等缺點［2］，在很大程度上限制了采用HPLC技術開展手性藥物對映體分離檢測的實驗教學(在國內高校的儀器分析實驗中幾乎是空白)。毛細管電泳(CE)結合電容耦合非接觸式電導檢測(C4D)的新型分離分析方法具有通用、靈敏、適用性強、易維護等優點;CE-C4D具有的高效、試劑消耗少、環境友好、分析成本低等特點使其在手性化合物的分離分析中極具應用前景［2-3］。

在大學化學實驗教學中，開設研究式開放性實驗是培養學生綜合實驗能力、創新能力以及社會適應能力的有效途徑［4-7］。通過研究式開放性實驗，學生既可以把基礎化學的理論知識和各種實驗技能及方法有機地結合起來，教師也可以將科學研究中獲得的新知識及時地融入到實驗教學環節中，不斷地更新教學內容。學生可以在做這類實驗的過程中探索研究的方法和獲取新知識。本文介紹的“毛細管電泳/非接觸式電導分離檢測手性藥物氧氟沙星對映體”實驗，是我們儀器分析實驗教學小組在科研成果基礎上開發出來的，并已經過我院4屆本科生的實際教學經驗積累的一個研究式開放性實驗。

1 實驗目的

熟悉高效毛細管電泳儀的基本原理和操作使用。了解毛細管電泳分離檢測手性藥物對映體的原理。學習和掌握手性藥物氧氟沙星對映體的CE-C4D分離檢測技術。

2 實驗原理

氧氟沙星(Ofloxacin，OFLX)是第3代喹諾酮類藥，屬于手性藥物，其對映體的分子結構如圖1所示。目前臨床使用的為外消旋體氧氟沙星和光學純體的左旋氧氟沙星(S-OFLX)。左旋氧氟沙星的抗菌活性是右旋(R-OFLX)的8～128倍［8］。在羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)構建的二元手性選擇劑體系中，HP-β-CD與R，S-OFLX形成主-客體結構包結物，由于HP-β-CD具有多個手性中心，能與對映體之間存在較好的手性選擇作用，使得兩個對映體在電泳淌度上表現出明顯的差異。HPMC屬水溶性非離子型纖維素醚，是甲基纖維素中部分甲氧基被羥丙氧基置換時得到的產物，具有手性協同作用，可以進一步穩定HP-β-CD包含物和增加HP-β-CD的手性識別能力和選擇性，進而繼續增加對映體在電泳淌度上的差異，從而實現對映體的CE-C4D基線分離和檢測。

圖1 氧氟沙星對映體的分子結構示意圖

3 儀器與試劑

CES2008毛細管電泳儀(配備CES2008-C4D/CD-1B型雙通道電導檢測器，中山大學化學與化學工程學院研制)，熔融石英毛細管(di=50μm，Leff=40cm);超聲波清洗器。0.45μm尼龍濾膜濾頭。

HAc，NaAc，HP-β-CD，HPMC，氧氟沙星對照品，市售左旋氧氟沙星片劑和氧氟沙星片劑，所用試劑為分析純，水為超純水。

電泳運行液:20mmol/L HAc+6mmol/L NaAc+12mg/L HPMC+35mmol/L HP-β-CD。

4 實驗內容

4.1 石英毛細管的處理

在使用前，依次用0.1mol/L的氫氧化鈉溶液、超純水和電泳運行液分別沖洗毛細管柱5min，在超聲波清洗器中清洗進樣瓶和儲液瓶。每兩次進樣之間，用電泳運行液沖洗毛細管柱3min，以保證良好的重現性。實驗結束后，要用超純水清洗進樣瓶、儲液瓶和毛細管。

4.2 樣品前處理

取市售左旋氧氟沙星和外消旋體氧氟沙星藥片各一片(標示含量0.100g/片)，分別放入50mL容量瓶中，加入約25mL超純水，在超聲波清洗器中助溶3min，定容。藥液經過0.45μm的濾膜過濾。取1.25mL濾液于25mL的容量瓶中，定容。進樣時，用50μmol/L HAc+5mmol/L HP-β-CD稀釋到合適濃度，進行CE-C4D分析。

4.3 實驗條件及儀器參數

在毛細管電泳/非接觸式電導分離檢測手性藥物氧氟沙星對映體的實驗中，影響實驗結果的因素較多。如:手性選擇劑和電泳運行液的組成和濃度，分離電壓，進樣電壓，進樣時間等。在這些影響因素中，有些涉及對映體的分離度，有些涉及分析方法的精密度和重現性;有些是關鍵因素，有些是次要因素。學生帶著研究性質進行實驗，可以對這些影響因素有全面的認識，在實驗過程中就能感到思路清晰。

儀器的參數為:分離電壓為+13kV，電動進樣:+11kV，8s。檢測器的輸出信號經數據工作站采集到微機中進行實時數據處理、圖形顯示和數據文件存儲。實驗在室溫、相對濕度＜70%的條件下進行。

4.4 樣品分析及結果

在選定的實驗條件下，按4.2節方法處理實際樣品和進樣分析。樣品分析分為定性分析和定量分析兩部分。在定性分析步驟中，通過標準加入法確定CE-C4D譜圖中與R，S-OFLX分別對應的電泳峰。結果表明，S-OFLX出峰在前，R-OFLX出峰在后(圖2)。為消除基體干擾，可用標準加入法或采用藥片輔料作為空白的標準曲線法計算片劑中氧氟沙星和左氧氟沙星的含量，兩種方法之間不存在顯著性差異。我們對某廠家同一批次的氧氟沙星藥片測定結果分別為0.103g/片和0.098g/片，與標示值0.100g/片一致。

圖2 手性藥物氧氟沙星片劑的對映體分離CE-C4D譜圖

5 教學實施及教學效果

由于本實驗內容較多，具有一定的復雜性和綜合度，因此將全部學生分成若干個小組，每組4～5人，每個小組指定一名小組長負責與教師聯絡。各小組獨立開展工作，小組內學生既有分工，又有合作。學生確定目標后，即著手查資料，研讀文獻。在此基礎上，先由學生提出實驗方案，經與教師討論修改后，即可開始實驗。實驗結束后，要求每個學生獨立完成實驗報告。實驗報告的最后部分是思考題，要求學生解答電泳運行液中各組分所起的作用，電泳譜圖中各電泳峰的歸屬和成因;并對本文方法與文獻方法的優缺點進行分析。

實驗室對學生全天開放(包括周末)，學生只要有時間，就可以到實驗室做實驗。學生帶著自己設計的方案進行實驗，實驗過程中既可以發揮集體的智慧，又能發揮學生個人的主觀能動性。學生可以利用學校圖書館、校園網絡查閱和收集參考資料，汲取自己所需要的知識信息解決實際問題;并運用所學過的理論知識和實驗技能，達到實驗所設定的目標，經歷了知識轉化為實際工作能力的過程。這一過程培養了學生解決問題的能力，可使他們正確運用網絡資源，體會到探索的樂趣。

這個研究式開放性實驗具有效率高、試劑消耗少、分析成本低的優點。目前在中山大學化學學院經過多年儀器分析實驗教學實踐，深受學生的歡迎，取得了良好的教學效果。

［1］黃量，戴立信.手性藥物的化學與生物學.北京:化學工業出版社，2002

［2］汪爾康.分析化學新進展.北京:科學出版社，2006

［3］北京大學化學系.儀器分析教程.第2版.北京:北京大學出版社，2007

［4］施開良，姚天揚，俞慶森.大學化學，2002，17(6):8

［5］施開良，姚天揚.中國高等教育，2003，17:27

［6］段連運，華彤文.大學化學，2005，20(6):5

［7］侯文華，丁維平，王志林.大學化學，2010，25(3):7

［8］國家藥典委員會編.中國藥典(2005版).北京:化學工業出版社，2005