金黃色葡菌球菌刺激巨噬細胞對JNK活化和Th1/Th2型細胞因子分泌的影響

肖文艷，方 磊，吳惠梅，丁佩山，劉榮玉

◇基礎醫學研究◇

金黃色葡菌球菌刺激巨噬細胞對JNK活化和Th1/Th2型細胞因子分泌的影響

肖文艷，方 磊，吳惠梅，丁佩山，劉榮玉

目的探討金黃色葡萄球菌（簡稱金葡菌）刺激小鼠巨噬細胞系RAW264.7對c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路活化及其對Th1/Th2型細胞因子表達的影響。方法體外培養小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞，以金葡菌的感染復數（MOI）值為10（金葡菌∶細胞＝10∶1）刺激RAW264.7細胞，設置時間點為0.5、1.0、1.5、2.0h。Western blot檢測金葡菌刺激后RAW264.7細胞JNK磷酸化水平，ELISA法檢測各時間點RAW264.7細胞上清液中白介素-5（IL-5）和干擾素-γ（IFN-γ）的表達水平。結果金葡菌刺激RAW264.7細胞后JNK磷酸化水平顯著升高，在0.5h最明顯（P＜0.01）；細胞上清液中IFN-γ水平在金葡菌刺激后0.5、1.0h顯著升高（P＜0.01），而在1.5、2.0h逐漸恢復到正常水平（P＞0.05）；IL-5水平在金葡菌刺激后1.0h時開始升高（P＜0.05），并在1.5、2.0h顯著升高（P＜0.01）；另外IL-5/IFN-γ在1.0、1.5、2.0h時差異均有統計學意義（P＜0.01）。結論金葡菌刺激小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞能夠活化JNK通路，并影響Th1/Th2型細胞因子的表達。

巨噬細胞；JNK；IL-5；IFN-γ

慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等多種肺部疾病的共同病理生理特征，是多種炎性細胞及細胞因子相互作用所致的氣道病變，在其病理生理過程中，巨噬細胞起著極其重要的作用。巨噬細胞在細菌毒素、煙霧等有害物質的刺激下，向肺組織遷移并釋放多種細胞因子如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白介素（interleukin，IL）-6、IL-5、IL-4等，這些細胞因子又可以趨化T淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等遷移進而導致氣道持續炎癥和嚴重損傷。研究［1］顯示金黃色葡萄球菌（簡稱金葡菌）細胞壁成分肽聚糖可以通過巨噬細胞表面Toll樣受體2（Toll-like receptor2，TLR2）介導活化絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）家族的c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino-terminal kinase，JNK）信號通路，特別是活化JNK信號通路能夠促進巨噬細胞吞噬金葡菌等病原體的過程［2］，并且活化的JNK信號通路能夠激活下游核轉錄因子系統釋放多種細胞因子。因此，該研究擬通過金葡菌刺激小鼠巨噬細胞來觀察JNK信號通路的活化及其對IL-5、INF-γ炎性細胞因子分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料小鼠單核－巨噬細胞系RAW264.7購于中國科學院上海細胞庫；金葡菌NCTC8325由中國科學技術大學生命科學學院教授饋贈；DMEM培養基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素均購于美國Invitrogen公司；胰蛋白胨、酵母提取物購于英國Oxoid公司；氯霉素購于上海現代哈森藥業有限公司；細胞裂解液由50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、0.1% SDS、1%Triton X-100、0.25%脫氧膽酸鈉，150 mmol/L氯化鈉和1 mmol/L EDTA配制而成，蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購于瑞士Roche公司；磷酸化JNK（p-JNK）、JNK多克隆抗體購于美國CST公司；GAPDH單克隆抗體購于上海康成生物公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗購于美國Promega公司；蛋白電泳轉移系統購于美國Bio-Rad公司；PVDF膜購于美國Millipore公司；ECL化學發光檢測試劑盒購于美國Thermo公司；熒光化學發光成像系統購于上海歐翔科學儀器有限公司；奧林巴斯倒置顯微鏡IX70購于日本Olmypus公司；IL-5、IFN-γ ELISA試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司（IL-5貨號：CSB-E04637m；IFN-γ貨號：CSBE04578m），IFN-γ試劑盒與IL-5試劑盒檢測范圍分別為15.60～1 000.00 pg/ml和31.25～2 000.00 pg/ml。

1.2 細胞培養RAW264.7細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，同時添加100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，5%CO2、37℃培養箱中培養，每2～3 d換液1次，每4～5 d根據細胞生長狀態傳代1次，保持細胞處于對數生長期生長。

1.3 細菌培養金葡菌在0.1%氯霉素的LB培養基（胰蛋白胨10 g/L；酵母提取物5 g/L；NaCl 10 g/L）中培養16h后，取對數生長期細菌測定其光密度值（optical density，OD）（OD650＝0.2，約合2×108/ml），用甘油將細菌凍存，－80℃保存。

1.4 金葡菌刺激細胞將對數生長期的RAW264.7細胞按1×105/ml的密度分別接種12孔板，培養過夜。PBS清洗金葡菌3次，用不含抗生素的DMEM培養基重懸并稀釋，將濃度調整至細胞∶金葡菌＝1∶10，將金葡菌加入細胞中分別刺激0、0.5、1.0、1.5、2.0h。

1.5 Western blot檢測細胞JNK蛋白磷酸化水平

各組細胞處理如1.4所示，收集上述各組細胞用PBS漂洗后，加入預冷的細胞裂解液100 μl，冰上裂解15 min，收集裂解產物，12 000 r/min 4℃離心15 min，將上清液移至新的EP管中，取少量用BCA法測定蛋白質含量，然后加入等體積2×loading buffer混勻，沸水中煮10 min，冷卻后－20℃保存。取25 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）將蛋白分離，再通過轉膜將蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加相應一抗p-JNK和JNK（1∶2 000）4℃過夜后置于室溫1h，TBST洗膜3次，每次15 min，加二抗（1∶2 000）室溫放置1h，TBST洗膜3次，每次15 min，ECL化學發光試劑孵育蛋白膜上后放入熒光化學發光成像系統中進行檢測，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。GAPDH作為內參，p-JNK與JNK灰度值的比值代表各組樣品p-JNK的相對表達量，同時也反映了JNK的磷酸化水平。

1.6 ELISA測定IL-5和IFN-γ的分泌量收集金葡菌刺激細胞后的培養基，1 500 r/min 4℃離心15 min，留取上清液，－80℃保存待測。用相應ELISA檢測試劑盒，按說明書操作規范分別檢測細胞上清中IL-5和IFN-γ的含量。

1.7 統計學處理采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，數據以ˉ±s表示，多組樣本均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較時采用Bonferroni檢驗。

2 結果

2.1 金葡菌刺激RAW264.7細胞綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的金葡菌刺激巨噬細胞后，顯微鏡觀察實驗組RAW264.7細胞與對照組RAW264.7細胞形態上的差異。金葡菌在感染巨噬細胞后，巨噬細胞開始皺縮變形，并逐漸形成吞噬囊泡進而內吞金葡菌。見圖1。

圖1 金葡菌刺激RAW264.7細胞 ×20

2.2 金葡菌刺激RAW264.7細胞后對p-JNK蛋白表達量的影響金葡菌刺激RAW264.7細胞后，Western blot檢測刺激不同時間段RAW264.7細胞中p-JNK蛋白的表達量。各時間段，金葡菌刺激后RAW264.7細胞的p-JNK蛋白表達量均明顯高于未刺激的RAW264.7細胞（P＜0.01），且0.5h組相比其余各組，p-JNK蛋白表達升高的水平最明顯（P＜0.01），見圖2。

2.3 金葡菌刺激RAW264.7細胞后對IL-5/IFN-γ分泌量的影響金葡菌刺激RAW264.7細胞后，ELISA檢測刺激不同時間段RAW264.7細胞上清液中IL-5和IFN-γ的分泌量，金葡菌刺激巨噬細胞后，1.0h實驗組與對照組IL-5分泌量差異有統計學意義（P＜0.05），1.5h和2.0h實驗組相比于對照組，IL-5分泌量差異有統計學意義（P＜0.01）；0.5h和1.0h實驗組與對照組IFN-γ分泌量差異有統計學意義（P＜0.01），并且0.5h實驗組分泌量最大（F＝269.064）；對IL-5、IFN-γ的分泌量進行相對比較時發現，隨著刺激時間的延長，IL-5與IFN-γ分泌量的比值（IL-5/IFN-γ）逐漸增大，且1.0、1.5和2.0h實驗組與0.5h實驗組差異均有統計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 處理不同時間的巨噬細胞分泌IL-5、IFN-γ的表達（n＝5±s）

表1 處理不同時間的巨噬細胞分泌IL-5、IFN-γ的表達（n＝5±s）

與對照組（0h）比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與0.5h比較：＃＃P＜0.01

項目0h0.5h1.0h1.5h2.0h IL-5（pg/ml）20.98±2.3325.41±1.9230.29±3.03*38.16±3.48**50.28±3.69**IFN-γ（pg/ml）14.53±2.2334.04±4.46**25.23±2.60**20.03±2.3416.75±1.94 IL-5/IFN-γ1.45±0.060.75±0.471.20±0.14＃＃1.90±0.10＃＃3.01±0.16＃＃

圖2 Western blot法檢測金葡菌刺激RAW264.7細胞后對p-JNK蛋白表達量的影響

3 討論

氣道防御屏障中的巨噬細胞介導的天然免疫反應在慢性炎癥中起著至關重要的作用，主要通過吞噬病原體和協調炎癥反應來調控天然免疫應答從而參與炎癥的慢性化。分布于巨噬細胞表面的Toll樣受體（TLRs）家族通過識別金葡菌細胞壁的組分如肽聚糖、脂磷壁酸等后介導下游信號分子JNK的活［3］，JNK信號通路被激活后，胞質中的JNK分子移位到細胞核，可以進一步促進核內的轉錄因子c-Jun氨基末端63及73位的絲氨酸殘基磷酸化，激活后的核轉錄因子系統可以釋放多種細胞因子參與調控細胞的遷移、增殖與分化［4］。另外JNK信號通路還可以通過上調吞噬相關基因（如清道夫受體CD36、SR-A）促進巨噬細胞吞噬金葡菌的過程［5］。

本實驗結果顯示金葡菌刺激小鼠巨噬細胞后，JNK磷酸化水平在30 min達到高峰，與此同時，分泌的IFN-γ水平也達高峰，這與Oltmanns et al［6］研究相一致。隨著金葡菌刺激時間的延長，JNK磷酸化水平開始降低并伴有IFN-γ分泌的減少，而在整個刺激過程中IL-5的分泌量表現為逐漸增加的趨勢。另外，該研究通過IL-5與IFN-γ分泌程度的相對比較來看，金葡菌感染的早期炎性細胞因子主要以IFN-γ為主，而后期IL-5的分泌則逐漸占據主導的地位，而Masuda et al［7］研究發現肥大細胞通過其表面TLR4識別G－菌細胞壁成分脂多糖后活化JNK信號通路并介導Th2型細胞因子（IL-5、IL-10、IL-13）分泌顯著升高，并且IL-5和IL-13能夠下調巨噬細胞分泌IL-12、IFN-γ，進而加重氣道炎癥，而本研究顯示巨噬細胞在吞噬金葡菌后同樣能夠活化JNK信號通路并介導IL-5分泌顯著升高。

巨噬細胞吞噬金葡菌后完成抗原提呈作用，輔助性T淋巴細胞（Thelper cells，TH）在抗原提呈細胞作用下開始活化，同時產生IL-2，活化的TH細胞在不同細胞因子環境下向Th1或Th2轉化（IL-4、IL-5促進Th2的分化，IL-12、IFN-γ促進Th1的分化）。本研究顯示在巨噬細胞吞噬金葡菌的后期以IL-5的分泌為主，據此推測在IL-5微環境下，TH細胞傾向于向Th2的分化。另外IL-5可以招募并誘導嗜酸性粒細胞（eosinophil，Eos）分化，JNK信號通路可能涉及到Eos的招募［8］。

Kim et al［9］發現金葡菌的定植與氣道慢性炎癥密切相關，金葡菌分泌的超抗原腸毒素具有強大的抗原刺激能力，在極低濃度下即可激活大量的T淋巴細胞，并且金葡菌細胞壁成分－肽聚糖和磷壁酸亦為單核/巨噬細胞和淋巴細胞強有力的刺激原，可誘導TNF-α、IFN-γ、IL-5等炎癥介質的大量合成與釋放［10］。且近年研究［11］顯示金葡菌與哮喘密切相關，其分泌出具有超抗原活性的腸毒素不僅能夠調節B、T淋巴細胞功能，還能夠激活其他炎性細胞（如巨噬細胞、嗜酸性粒細胞等）。

綜上所述，本研究顯示金葡菌刺激巨噬細胞后活化JNK信號通路并對炎性細胞因子IL-5、IFN-γ有調控作用，提示JNK信號通路可能參與氣道慢性疾病的發生。

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Effects of Staphylococcus aureus on the activation of JNK and secretion of Th1/Th2 cytokines in murine macrophage

Xiao Wenyan，Fang Lei，Wu Huimei，et al
（Dept of Pulmonary，Anhui Geriatrics Institute，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the effects on c-Jun amino-terminal kinase（JNK）expression and Th1/Th2 cytokines secretion from mouse macrophage cell line RAW264.7 stimulated by Staphylococcus aureus（S.aureus）.MethodsRAW264.7 cells were cultured in vitro，then were stimulated by S.aureus at a multiplicity of infection（MOI）of 10（S.aureus∶cells＝10∶1）for 0.5，1.0，1.5 and 2.0h respectively.The protein expression of p-JNK was analyzed by Western blot，the levels of interleukin-5（IL-5）and interferon-γ（IFN-γ）in the supernatants of each group were analyzed by ELISA.ResultsAfter stimulating by S.aureus，the level of JNK phosphorylation was significantly increased and was maximized at 0.5h（P＜0.01）；the level of IFN-γ was significantly increased at 0.5，1.0h（P＜0.01），but back to normal level at 1.5 and 2.0h（P＞0.05）；IL-5 began to increase at 1.0h and 1.5h（P＜0.05），and was significantlyhigher at 2.0h（P＜0.01）；additionally，the ratio of IL-5/IFN-γ was significantly increased at 1.0，1.5 and 2.0h（P＜0.01）.ConclusionS.aureus stimulation activates JNK signaling and regulates the balance of Th1/Th2 cytokines in murine macrophages.

macrophage；c-Jun amino-terminal kinase；interleukin-5；interferon-γ

R 562.2＋5；Q 241；Q 74

A

1000－1492（2014）04－0423－04

2014－02－17接收

國家自然科學基金（編號：81270083、81170030）；安徽省重點實驗室計劃項目（編號：1206c0805028）；安徽省科技攻關項目（編號：12010402135）

安徽醫科大學第一附屬醫院干部呼吸科，安徽省老年病研究所，合肥 230022

肖文艷，男，碩士研究生；劉榮玉，女，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：rongyuliu＠gmail.com