人端粒酶逆轉錄酶基因的表觀遺傳學調控

吳小琴綜述 李 俊審校

◇綜 述◇

人端粒酶逆轉錄酶基因的表觀遺傳學調控

吳小琴1，2綜述 李 俊1，2審校

人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）是控制端粒酶活性的限制性成分。hTERT的表達受多種因素的調控，其中表觀遺傳學可通過DNA甲基化，組蛋白修飾及非編碼RNA調控hTERT基因的表達。有關hTERT基因表達的表觀遺傳學研究近幾年取得了較大進展。hTERT基因啟動子區甲基化的狀態、位點、作用及其臨床意義，非編碼RNA對hTERT基因的表達調控等已成為研究的熱點。本文就表觀遺傳學對hTERT基因表達的調控作一綜述。

端粒酶；人端粒酶逆轉錄酶；表觀遺傳學；DNA甲基化；組蛋白修飾；非編碼RNA

端粒是真核細胞染色體末端的特殊結構，可維持染色體的完整性和結構穩定性等［1］。在正常細胞分裂過程中由于末端復制問題，端粒逐漸縮短，最終導致細胞衰老、死亡，而大多數腫瘤細胞則能通過端粒酶添加端粒重復序列TTAGGG至DNA末端，阻止端粒隨著細胞分裂而縮短，從而使細胞具有無限增殖的能力［2］。因此，端粒酶的活化是惡性腫瘤的普遍現象，在惡性腫瘤中其活性檢出率為85%～95%［3］。人的端粒酶主要由端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）、端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）和端粒相關蛋白（human telomerase-associated protein 1，hTP1）構成。端粒酶依靠自身RNA模板，在hTERT催化下與hTP1作用合成端粒DNA。其中，hTERT的表達程度與端粒酶的活性密切相關，hTERT在單個體細胞內的轉錄水平為1～5拷貝，而在腫瘤細胞中基因拷貝數增加［4］。因此對hTERT表達的調控成為端粒酶研究的熱點。關于hTERT的調控有很多因素，比如各種小分子抑制劑、轉錄因子、hTERT磷酸化及顯性負性突變體等。

表觀遺傳學是指在不改變DNA序列的前提下使基因表達發生可遺傳性的變化，最終導致帶有相同DNA序列的各種細胞及組織具有不同的基因表達模式和生物學功能。表觀遺傳學調控主要有DNA甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA等，它們在人類各種疾病，尤其是腫瘤的發生發展過程中發揮著重要作用。有研究［5］表明，表觀遺傳調控hTERT的活性。本文就關于hTERT基因表觀遺傳學調控的研究進展作一綜述。

1 DNA甲基化

1.1 hTERT基因結構特點人類hTERT基因位于第5號染色體短臂5p15.33區，由16個外顯子和15個內含子組成，總長約35 kbp。hTERT基因啟動子序列位于5’端一個5.8 kbp的基因片段中，轉錄起始點的上游181 bp區為核心啟動子，其序列上存在多個hTERT轉錄因子（Sp1、c-myc、Est、Mad-1等）的結合位點。hTERT基因的轉錄受控于其啟動子的調控。在hTERT基因啟動子區有一個富含GC區，構成一個CpG島，分別定位于－208～－150 bp、－310～－20 bp、－330 bp至第2個外顯子之間、轉錄起始點上游181 bp或283 bp區域，長度59～290 bp不等，該島被認為是DNA甲基化的一個靶點。

1.2 hTERT基因啟動子甲基化狀態及作用Nomoto et al［6］應用PCR和單鏈構象多態性技術，對13株胃腸腫瘤細胞系、24例腸癌標本及8例正常志愿者外周血細胞經亞硫酸氫鹽處理后分析，發現11種細胞系hTERT啟動子序列呈高甲基化的狀態；在腫瘤標本中6例hTERT啟動子完全甲基化，17例呈部分甲基化，而正常組織多為非甲基化狀態。Cong et al［7］發現腫瘤細胞中hTERT啟動子核心區（－500 bp）呈現高度甲基化狀態。以上研究表明hTERT啟動子處于高甲基化狀態，然而hTERT啟動子的這種甲基化狀態與其基因表達二者之間的關系尚不明確。多數研究表明DNA甲基化可以沉默基因表達，Liu et al［8－9］和Lopatina et al［10］證實hTERT啟動子甲基化可沉默hTERT基因表達。另外也有研究［11－12］表明二者之間并無顯著關系。然而越來越多研究表明在腫瘤細胞中hTERT調控區的甲基化狀態促進hTERT基因的表達。Guilleret et al［13］研究發現hTERT啟動子甲基化與hTERT表達呈正相關，并且端粒酶陽性細胞系用去甲基化試劑5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）處理后hTERT表達下降，端粒酶活性降低及端粒縮短。這種情況下CpG甲基化可能是通過干擾轉錄抑制因子的結合，從而正調控hTERT啟動子。造成以上這些不同的研究結果可能的原因是臨床標本中有正常組織的存在或由不同的研究方法導致。De Wilde et al［14］對人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）誘導的致癌作用分析發現宮頸癌細胞株中hTERT啟動子甲基化程度與腫瘤表型的進展一致，但臨床樣本差異無統計學意義。

目前多數學者認為hTERT啟動子的高甲基化通過與抑制性轉錄因子作用，進而影響hTERT基因的表達。Renaud et al［15］通過染色質免疫沉淀實驗發現當hTERT基因的第一外顯子非甲基化時，與hTERT轉錄抑制因子CTCF結合并抑制hTERT的轉錄起始；而第一外顯子的調控序列發生甲基化時，CTCF不能與此結合位點結合，即解除CTCF對hTERT表達的抑制作用。從而推測hTERT啟動子CpG島甲基化的主要目的可能是為了阻斷CTCF的結合，從而促進hTERT的轉錄。Choi et al［16］應用曲古柳菌素（Trichostatin A，TSA）下調DNA甲基轉移酶（DNMT1）誘導hTERT啟動子CpG島特定位點去甲基化，發現在這個去甲基化區域有CTCF的一個結合位點，位于CpG島的31st和33rd之間。當TSA誘導CpG島特定位點的去甲基化時，促進了CTCF與hTERT啟動子上位點結合，從而抑制hTERT的轉錄。然而，研究表明hTERT啟動子完全甲基化明顯抑制hTERT轉錄，而啟動子局部的低甲基化對hTERT的表達起關鍵作用。Zinn et al［17］研究發現在腫瘤細胞中盡管hTERT啟動子上游很多區域高度甲基化，但轉錄起始位點附件區域（－150～150 bp）的DNA低甲基化甚至非甲基化。如上所述，hTERT啟動子甲基化作用與一般慣例不同。然而，對于啟動子的高甲基化狀態及部分區域低甲基化與hTERT表達的具體關系仍待深入研究。

2 組蛋白修飾

2.1 組蛋白乙酰化組蛋白的乙酰化和去乙酰化是一個可逆的動態過程，主要發生在組蛋白分子N端賴氨酸殘基上，由組蛋白乙酰轉移酶（histone acetylase，HAT）和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）調控。Choi et al［18］和Meeran et al［19－20］研究發現hTERT啟動子區域的組蛋白在HAT的作用下發生乙酰化，可導致DNA空間結構處于松弛狀態，從而有利于轉錄因子與之結合，使轉錄效率大大提高，即組蛋白乙酰化可激活hTERT基因的轉錄。相反，在HDAC作用下組蛋白去乙酰化，引起染色質DNA高度凝縮，轉錄因子難于與之相應的順式反應元件結合，使hTERT轉錄受到抑制。Mao et al［21］研究表明NAD依賴性的組蛋白去乙酰化酶Sirt1與c-myc轉錄因子的C端相互作用，導致c-myc體外和體內去乙酰化。而且這種脫乙酰化作用促進c-myc與其活化分子MAX結合，從而促進了hTERT啟動子上c-myc的轉錄激活。Choi et al［16］又發現HDAC抑制劑（HDACi）增強了HAT共激活復合體將乙酰基轉移到組蛋白賴氨酸Lys殘基的能力，導致核染色質結構開放，從而激活或抑制hTERT等基因，最終促進了不同轉錄因子如CTCF、c-myc及MAD1等與啟動子結合。另也有研究［22］表明在正常細胞中TSA以Sp1依賴的方式誘導表達hTERT和端粒酶活性。

2.2 組蛋白甲基化有文獻報道另一重要形式組蛋白甲基化也調控hTERT表達。Atkinson et al［23］發現腫瘤細胞中H3-K4三甲基化激活hTERT基因轉錄。Liu et al［24］對腫瘤細胞研究發現組蛋白甲基轉移酶（SMYD3）在hTERT啟動子調控中起著至關重要的作用。SMYD3使H3-K4發生三甲基化，募集HAT導致染色體構象開放，從而有利于c-myc與Sp1結合；同時沉默SMYD3可減弱H3-K4甲基化和H3乙酰化，最終抑制hTERT轉錄及端粒酶活性。Ge et al［25］也發現DNA甲基化和組蛋白H3-K9修飾影響c-myc與hTERT啟動子上E-box1位點結合，同時沉默c-myc明顯抑制hTERT表達。綜上所述，研究表明hTERT的表達可能是由表觀遺傳學（DNA甲基化和組蛋白修飾）及轉錄因子共同相互調控的結果。

3 非編碼RNA

3.1 microRNAsmicroRNAs也叫miRNAs或miRs，是一類由內源基因編碼的長度為20～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在細胞分化、生物發育及疾病發生發展過程中發揮重要作用。隨著非編碼RNA，尤其是microRNAs成為基因表達調控的研究熱點，其在hTERT表達調控中的作用也逐漸被認識。

Mitomo et al［26］首次報道了與端粒酶活性相關的miRNAs。研究者選取并分析正常甲狀腺及甲狀腺癌細胞中差異表達的miRNAs，最終較乳突狀甲狀腺癌相比，低分化型甲狀腺癌細胞中miR-138表達顯著下降。同時miRs在線數據庫預測miR-138的潛在靶點是hTERT。因此將miR-138前體分子轉入甲狀腺癌細胞中，應用Western blot和熒光素酶報告基因系統檢測hTERT表達明顯下調。從而推測miR-138與hTERT mRNA的3＇UTR靶點結合抑制翻譯過程，進而下調hTERT表達和抑制端粒酶活性。miRNAs的活性具有細胞特異性，除miR-138以外，其他miRNAs在其他組織細胞中也參與調控hTERT活性。Miura et al［27］研究表明人染色體10p可能含有調控hTERT表達的基因，從而應用細菌人工染色體克隆研究發現與正常肝細胞相比，肝癌細胞中RGM249（編碼miRNAs的前體基因，位于10p15.3區）高表達，基本與hTERT表達一致；同時發現RGM249可顯著降低hTERT mRNA水平。另外，Wang et al［28］研究表明miR-21在膠質母細胞瘤的細胞增殖調控中起著十分重要的作用，并以STAT3依賴的方式調控hTERT表達影響細胞增殖。

3.2 長鏈非編碼RNA近年來研究［29］表明另一種非編碼RNA，TERRA（或TelRNA）參與端粒酶的調控。哺乳動物的TERRA分子是一段含有UUAGGG重復序列，大小為100～9 000 bp的長鏈非編碼RNA。研究認為TERRA可能以兩種方式抑制端粒酶活性，一種是與它的互補性序列作用阻滯RNA部分（hTR），另一種是影響端粒區的異染色質［30］。而Redon et al［31］同時也發現TERRA也可以hTR非依賴形式與hTERT相互作用改變其結構從而抑制端粒酶活性。目前研究結果僅提示，非編碼RNA可能對hTERT起到調控，但還未能闡明它們是通過何種機制來發揮調控作用，這有待進一步探索。

4 前景與存在的問題

通過對腫瘤組織及細胞的研究，揭示了表觀遺傳學對hTERT基因表達的調控作用。這為進一步研究腫瘤的發生機制及診斷治療方法提供新途徑。如Widschwendter et al［32］研究發現宮頸癌患者hTERT啟動子甲基化的預后遠差于未發生甲基化患者。但是調控hTERT表達是多重因素多種機制，未來還應進一步探討hTERT啟動子的高甲基化狀態與其表達之間的具體關系，microRNA與DNA甲基化和組蛋白修飾如何相互作用調控hTERT表達等。

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R 349.64

A

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2013－10－28接收

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安徽醫科大學1藥學院、2肝病研究所，合肥 230032

吳小琴，女，碩士研究生；李 俊，男，博士，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：lj＠ahmu.edu.cn