山葡萄轉錄因子CBF1基因的克隆及其遺傳轉化體系

劉洋

摘 要：根據山葡萄的CBF1基因序列設計一對特異引物，克隆出山葡萄（Vitis amurensis）栽培品種 ‘雙優的抗寒轉錄因子CBF1基因，并將其構建到pBI121表達載體中，獲得山葡萄轉錄因子CBF1基因的植物表達載體，命名為pBI121-ViCBF1，利用農桿菌介導葉盤轉化‘巨峰葡萄以研究高效的‘巨峰葡萄轉化體系。結果表明，以農桿菌LBA4404為介導菌株，以‘巨峰葡萄葉片為外植體、3 d為預培養時間和4～5 d共培養時間、400 mg·L-1羧芐青霉素，50 mg·L-1卡那霉素篩選濃度轉化效果較好，并已篩選到6株轉基因植株，PCR檢測均為陽性，為提高‘巨峰葡萄的抗寒性建立了初步的技術基礎。

關鍵詞：山葡萄；表達載體；轉錄因子；遺傳轉化

中圖分類號：S663.1 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.02.002

Cloning of Transcription Factor CBF1 of Vitis amurensis and Its System of Genetic Transformation

LIU Yang

（Changchun Vocational University， Changchun， Jilin 130033，China）

Abstract： Designing a pair of single primer by CBF1 gene of Vitis amurensis，cloning transcription factor CBF1 gene of Vitis amurensis， the vector of pBI121-ViCBF1 was constructed and transformed to Vitis labruscana Kyoho by agrobacterium-mediated method. The regenerated resistant plants could be obtained by pre-culturing for 3 d， coculturing with Agrobacterium tumefaciens LBA4404 for 4～5 d， and then transferred to the callus inducement media containing 400 mg·L-1 Carb and 50 mg·L-1 Kan for 28 d. Under this construction， the rate of plant transformation was relatively higher and six putative transgenic plants had gotten， product of PCR was positive， the system was an elementary technology for increasing cold resistance of Vitis labruscana Kyoho.

Key words： Vitis amurensis； expression vector； transcription factor； genetic transformation

當前，隨著農業生態環境的不斷惡化，低溫、干旱及高鹽嚴重威脅著現代化農業的發展。我國東北和西北兩地農作物凍害發生普遍，因凍害所造成的損失也十分嚴重。我國東北山葡萄抗寒性最強（耐-40 ℃低溫），在山葡萄中發現的CBF 低溫反應途徑是，通過CBF 轉錄因子調控大量下游有CRT/DRE（C-repeat/dehydration responsive element）調控元件的COR（cold-regulated）基因的表達，來提高植物的抗凍力[1-2]。據報道，大量表達擬南芥CBF1基因的轉基因植物，其抗寒性平均提高了10.8 ℃[3]。因此，大量表達抗寒功能更強的山葡萄CBF1基因的‘巨峰葡萄，其抗寒能力很可能強于轉擬南芥CBF1基因的植株，這種轉基因‘巨峰葡萄將能在東北乃至更寒冷的地區露地安全越冬，從而改變傳統的“埋土防寒”措施，減少作物因低溫天氣造成的減產，具有廣闊的應用前景。

1 材料和方法

1.1 材 料

山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）栽培品種‘雙優、‘巨峰葡萄（Vitis labruscana Kyoho）、大腸桿菌E.coli DH5α、農桿菌LBA4404感受態細胞、表達質粒pBI121均由吉林農業大學生命科學院提供。克隆載體為pGEM-T easy vector購自寶生物工程（大連）有限公司。TaqDNA聚合酶、限制性內切酶T4DNA連接酶購自上海生工生物工程公司。DNA提取試劑盒、及切膠回收試劑盒均購自寶泰克公司。

1.2 山葡萄CBF1基因的克隆

根據已知的山葡萄CBF1基因序列設計引物，在其上游、下游分別引入XbaⅠ、SacⅠ酶切位點，上游引物：5′-CCATCTAGACCATGGACTCGGACCACGAAG-3′，下游引物：5′-TGAGCTCTTAATCATCATTCCACAAAGACAAGTC-3′。引物由Takara（大連）公司合成。

提取山葡萄的RNA，逆轉錄后獲得cDNA，并以此為模版PCR擴增后獲得CBF1基因的編碼序列，連接在pMD18-T載體上轉化大腸桿菌，提取質粒酶切鑒定，最后進行測序。

逆轉錄體系為：取mRNA5 μL（≤2 μg），反轉錄酶4 μL，buffer（5×）4 μL，dNTP （10 mmol·L-1）2 μL，RNase Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，DEPC水3.5 μL，70 ℃水浴變性5 min，冰浴5 min稍離心，慢慢混勻后，低速離心，收集液滴，42 ℃溫浴60 min，85 ℃加熱10 min滅活反轉錄酶，得到cDNA。

PCR反應體系：以cDNA為模板進行PCR擴增，20 μL的體系包括0.5 μL cDNA，2 μL buffer（10×），2 μL Mg2+（25 mmol·L-1），0.25 μL dNTP（10 mmol·L-1），0.5 μL P1，0.5 μL P2，0.25 μL Taq酶（5 U·μL-1），14 μL ddH2O，擴增引物見表1，擴增程序為下：94 ℃預變性6 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃60 s，72 ℃延伸8 min。4 ℃保存。循環后72 ℃保溫延伸10 min。

1.3 植物表達載體pBI121-ViCBF1的構建

用XbaⅠ和SacⅠ分別酶切目的基因和質粒載體，目的DNA 片段回收后用T4 連接酶連接，并將此重組體轉化導入大腸桿菌DH5α 感受態細胞中，在含有50 mg·L-1Amp 的培養基平板上培養，挑取白斑用XbaⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定，得到植物表達載體pBI121-ViCBF1。

1.4 遺傳轉化體系的建立

農桿菌液侵染外植體和與其共培養。在轉化前1 d，將已轉化了植物表達載體質粒的農桿菌菌液接種于YEP液體培養基上（含利福平30 mg·L-1、卡那霉素50 mg·L-1），27 ℃，180 r·min-1培養過夜， 4 ℃4 000 r·min-1離心5 min，取沉淀用無菌的MS液體培養基稀釋，測定OD600值分別為0.2，0.4，0.6，0.8時取出使用。取切好的葉片，分別在愈傷組織誘導芽分化培養基上預培養1，2，3，4，5 d。后將預培養后的外植體放入農桿菌菌液中7～10 min，取出后用無菌紗布吸干外植體表面殘留的菌液，然后接種于放入不含任何抗生素的愈傷組織和不定芽誘導培養基，25 ℃暗室共培養3，4，5，6 d，待葉片在培養基接觸處長出肉眼可見菌落時，轉入含有卡那霉素（20，30，40，50 mg·L-1）和羧芐青霉素（300，400，500，600 mg·L-1）的愈傷組織誘導和不定芽分化培養基中，一個月后統計分化率，將篩選出的再生苗轉入含有抗生素的根誘導培養基中誘導生根，形成再生植株。

1.5 篩選轉基因純合植株

待芽長至1 cm左右時切下，移入MS生根培養基（含羧芐青霉素400 mg·L-1，卡那霉素50 mg·L-1）中，促其生根，根系發育好后（5～6片葉），提取葉片組織DNA，進行基因CBF1的PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 山葡萄CBF1基因的擴增

通過PCR擴增得到山葡萄CBF1基因特異片段，經測序結果為752 bp，與預期相符，如圖1。山葡萄CBF1基因的開放閱讀框包含752個核苷酸對。

2.2 山葡萄植物表達載體pBI121-ViCBF1的構建

2.2.1 植物表達載體的構建 在CBF1基因兩端引入XbaI 和SacⅠ酶切位點，分別用XbaI 和SacⅠ分別酶切目的基因和pBI121載體，構建pBI121-ViCBF1表達載體（圖2）。

2.2.2 植物表達載體的鑒定 經PCR鑒定為陽性的菌液提取質粒，用XbaI 和SacⅠ雙酶切鑒定重組質粒，電泳結果中出現一條752 bp左右的目的條帶（圖3）。

2.2.3 根癌農桿菌菌落PCR檢測 挑選農桿菌陽性克隆進行菌落PCR檢測，出現預期條帶（圖4），XbaI 和SacⅠ雙酶切鑒定也顯示同樣大小的目的條帶，表明CBF1插入到了載體中，表明已成功構建植物表達載體，可用于‘巨峰葡萄的遺傳轉化。

2.3 ‘巨峰葡萄遺傳轉化體系的建立

2.3.1 農桿菌的濃度及預培養、共培養時間對遺傳轉化效率的影響 農桿菌的濃度適宜才能實現有效轉化[4-6]。本試驗中侵染‘巨峰葡萄的農桿菌濃度是OD600=0.6～0.8，侵染時間控制在6 min最適宜。

外植體的預培養時間過長會導致傷口愈合，不利于外源基因的轉化，本試驗中適宜的預培養時間為3 d（圖5）。外植體與農桿菌的共培養時間太短不利于基因的轉化，共培養時間過長，農桿菌過渡繁殖造成外植體的褐化死亡。試驗中，‘巨峰葡萄與農桿菌的共培養時間應控制在4～5 d（圖6）。

2.3.2 抗生素敏感性試驗 本試驗采用羧芐青霉素的抑菌效果進行篩選[7]。本試驗確定羧芐青霉素濃度為400 mg·L-1為最適宜濃度，此濃度培養基中農桿菌的生長受到有效抑制。

不同植物基因型不同，對卡那霉素的敏感性也不同[8-9]。本試驗中，卡那霉素對對‘巨峰葡萄的生長有明顯的抑制作用。當卡那霉素濃度為50 mg·L-1時，‘巨峰葡萄無法正常生長（圖7），此濃度是較為適宜的篩選濃度。因此，以卡那霉素濃度50 mg·L-1，羧芐青霉素濃度為400 mg·L-1篩選‘巨峰葡萄擬轉基因植株（圖8）。

2.3.3 轉基因‘巨峰葡萄PCR檢測 僅憑卡那抗性篩選得到的陽性植株，并不能充分說明就是轉基因植株。因為不同個體間的卡那抗性也有差異，另外該基因是否在后代中穩定表達，還需用分子生物學手段來檢測[10]，最方便快捷的方法是PCR擴增。待轉基因‘巨峰葡萄長到5～6片葉片時，為了篩選帶有CBF1基因的轉基因‘巨峰葡萄植株，對篩選到的6株擬轉基因植株進行PCR檢測。結果表明，轉基因‘巨峰葡萄6個單株均擴增出了特異性的目的條帶（圖9）。

3 結論與討論

本研究初步建立了山葡萄CBF1基因的植物表達載體pBI121-ViCBF1，為了提高pBI121-ViCBF1對‘巨峰葡萄的轉化效率，在試驗中確立了外植體預培養時間為3 d、農桿菌的侵染濃度OD600=0.6～0.8、外植體與農桿菌的共培養時間4～5 d。并對羧芐青霉素濃度及篩選陽性植株的卡那霉素濃度進行了優化（羧芐青霉素濃度為400 mg·L-1，卡那霉素濃度50 mg·L-1），以此濃度作為‘巨峰葡萄抗性植株的篩選，88個外植體篩選到6株擬轉基因植株，轉化率為6.81%，PCR檢測結果均為陽性，初步說明轉錄因子CBF1基因已經整合到‘巨峰葡萄的基因組DNA中。

此外，本研究構建了pBI121-ViCBF1單子葉植物表達載體，利用CaMV35S啟動子啟動CBF1基因在‘巨峰葡萄中的超表達，在提高基因植株耐逆性的同時，還會產生生長遲緩、植株矮化、產量下降等不良影響，但這種負效應可以用植物內源特異性啟動子rd29A基因取代CaMV35S來在很大程度上減輕這種負效應，從而提高抗寒基因工程的實效性。

參考文獻：

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[9] 魏愛民，張文珠，杜勝利，等.黃瓜花粉管通道法抗蟲基因導入及卡那霉素抗性篩選[J].華北農學報，2008（6）：54-57.

[10] 宋書鋒，曹鳳，楊培志，等. 普那菊苣高效再生體系建立和遺傳轉化研究[J].分子植物育種，2006（4）：123-128.

此外，本研究構建了pBI121-ViCBF1單子葉植物表達載體，利用CaMV35S啟動子啟動CBF1基因在‘巨峰葡萄中的超表達，在提高基因植株耐逆性的同時，還會產生生長遲緩、植株矮化、產量下降等不良影響，但這種負效應可以用植物內源特異性啟動子rd29A基因取代CaMV35S來在很大程度上減輕這種負效應，從而提高抗寒基因工程的實效性。

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此外，本研究構建了pBI121-ViCBF1單子葉植物表達載體，利用CaMV35S啟動子啟動CBF1基因在‘巨峰葡萄中的超表達，在提高基因植株耐逆性的同時，還會產生生長遲緩、植株矮化、產量下降等不良影響，但這種負效應可以用植物內源特異性啟動子rd29A基因取代CaMV35S來在很大程度上減輕這種負效應，從而提高抗寒基因工程的實效性。

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