一種與膽固醇7，8位脫氫相關(guān)蛋白的表達(dá)研究

湯 睿，申雁冰，格日勒，牛丹丹，王 敏

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

一種與膽固醇7，8位脫氫相關(guān)蛋白的表達(dá)研究

湯 睿，申雁冰，格日勒，牛丹丹，王 敏

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

家蠶(Bombyx mori)的Nvd-Bm蛋白是一種與膽固醇7，8–脫氫酶相關(guān)的蛋白．根據(jù)NCBI中報(bào)道的家蠶中的膽固醇7，8–脫氫酶基因序列(GenBank登錄號(hào)：AB232986.1)，采用密碼子優(yōu)化及基因克隆技術(shù)，擴(kuò)增獲得膽固醇7，8–脫氫酶目標(biāo)基因nvd-Bm，并構(gòu)建了重組穿梭載體pPIC9K-nvd-Bm，通過(guò)電轉(zhuǎn)化，成功構(gòu)建了含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115異源真核表達(dá)工程菌株．經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳分析表明，含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母GS115表達(dá)菌株能夠成功表達(dá)目標(biāo)蛋白，為膽固醇的7，8–脫氫產(chǎn)物即7–脫氫膽固醇的生物轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)．關(guān)鍵詞：家蠶；膽固醇7，8–脫氫酶；密碼子優(yōu)化；畢赤酵母；誘導(dǎo)表達(dá)

維生素D是一種作用于鈣、磷代謝的維生素[1]，它能夠維持人及其他動(dòng)物體內(nèi)的血磷和血鈣的平衡，促進(jìn)骨質(zhì)鈣化以及腸道對(duì)鈣磷等元素的吸收[2]．其中最重要的是維生素D2(麥角骨化醇)和維生素D3(膽鈣化醇)．維生素D3在維生素D生物代謝中活性最高，主要由高級(jí)動(dòng)物的表皮和真皮內(nèi)含有的7–脫氫膽固醇經(jīng)紫外線(波長(zhǎng)265～228,nm)照射轉(zhuǎn)變而成，也可來(lái)自如肝類(lèi)、魚(yú)肝油等動(dòng)物組織中[3–5]．而7–脫氫膽醇主要由膽固醇經(jīng)膽固醇7，8–脫氫酶作用轉(zhuǎn)變生成，膽固醇7，8–脫氫酶是合成維生素D3的重要生物催化劑．

膽固醇7，8–脫氫酶主要參與蛻皮動(dòng)物類(lèi)固醇生物合成過(guò)程第一步重要反應(yīng)，其主要功能是催化膽固醇轉(zhuǎn)化為7–脫氫膽固醇．目前膽固醇7，8–脫氫酶在分子水平上的作用機(jī)制尚不清楚[6]．Yoshiyama等[7]發(fā)現(xiàn)，家蠶前胸腺中的neverland基因(nvd-Bm)與7，8–脫氫酶相關(guān)．通過(guò)RNA干擾和基因敲除技術(shù)獲得的nvd-Bm缺失家蠶幼蟲(chóng)，其體內(nèi)蛻皮激素的產(chǎn)生量明顯降低而影響其生長(zhǎng)，這一干擾可以通過(guò)補(bǔ)充7–脫氫膽固醇解除．夏小斌等[8]及Capyk等[9]在秀麗隱

桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)中發(fā)現(xiàn)了功能類(lèi)似的基因daf-36(GenBank登錄號(hào)：NM_073228.4)，并證明該酶屬于Rieske非血紅素鐵加氧酶，包含一段Rieske[2Fe-2S]區(qū)域以及一段非亞鐵血紅素關(guān)聯(lián)區(qū)，可催化膽固醇轉(zhuǎn)化為7–脫氫膽固醇，表明nvd-Bm基因具有編碼膽固醇7，8–脫氫酶的作用．

目前，黃時(shí)海等[10]實(shí)現(xiàn)了基因nvd-Dm在大腸桿菌中的少量表達(dá)，表達(dá)效率偏低．本研究主要克隆了來(lái)自家蠶的nvd-Bm基因(GenBank登錄號(hào)：AB232986.1)，采用密碼子優(yōu)化技術(shù)，構(gòu)建了nvd-Bm基因的真核表達(dá)工程菌并實(shí)現(xiàn)了重組Nvd-Bm蛋白的高效表達(dá)．研究結(jié)果為進(jìn)一步進(jìn)行其與伴侶蛋白的共表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115及pPIC9K載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存；優(yōu)化后的nvd-Bm基因及5’AOX1 / 3’AOX1引物，由金唯智公司合成．

引物5’AOX1的序列為：5′-GACTGGTTCCAAT TGACAAGC-3′；引物3’AOX1的序列為：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′．

1.2 培養(yǎng)基、酶及試劑

畢赤酵母GS115培養(yǎng)基的配制方法參見(jiàn)Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)；大腸桿菌DH5α的培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基[11]．

EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、NotⅠ限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白Marker，大連寶生物公司；T4,DNA連接酶，Promega公司；Taq PCR Master Mix，博邁德公司；酵母提取物、蛋白胨，Oxiod公司；膠回收試劑盒，北京天恩澤基因公司；其他化學(xué)試劑均購(gòu)自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠．

1.3 膽固醇7，8–脫氫酶基因的獲取

通過(guò)查閱文獻(xiàn)及NCBI中比對(duì)，獲得nvd-Bm基因全序列(GenBank登錄號(hào)：AB232986.1)；并利用Vector NTI suite 7.0等分子生物學(xué)軟件，在不改變其蛋白質(zhì)氨基酸序列的前提下，綜合考慮密碼子使用頻率、GC含量的調(diào)整、不穩(wěn)定序列的刪除、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)等影響因素，按照巴斯德畢赤酵母的偏愛(ài)性對(duì)該序列進(jìn)行密碼子改造優(yōu)化[12]．并于目標(biāo)基因nvd-Bm兩側(cè)引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)后，委托金唯智公司進(jìn)行全基因合成．

1.4 畢赤酵母重組表達(dá)菌株的構(gòu)建

用EcoRⅠ和NotⅠ將由公司合成并連有目標(biāo)基因的重組克隆載體pUC57-nvd-Bm及畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K進(jìn)行雙酶切，回收1.3,kbp的片段及pPIC9K骨架，回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選得到重組表達(dá)載體pPIC9K-nvd-Bm，對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行PCR鑒定及雙酶切鑒定，并將鑒定正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證．

將篩選得到的重組表達(dá)載體pPIC9K-nvd-Bm經(jīng)BglⅡ線性化，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，電擊條件：1.5,kV、25,μF、200,?．轉(zhuǎn)化菌液分別涂布于含4,g/L G418的YPD平板上，30,℃孵育至抗性克隆出現(xiàn)．

挑取抗性克隆，通過(guò)玻璃珠和酚氯仿抽提酵母基因組，以基因組為模板，利用5’AOX1/3’AOX1引物進(jìn)行PCR篩選成功整合的陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性克隆菌株于YPD培養(yǎng)基中，30,℃培養(yǎng)20,h后，保存甘油管．

1.5 重組質(zhì)粒在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)及SDSPAGE分析

將篩選出的陽(yáng)性克隆接種于100,mL BMGY中，30,℃、250,r/min生長(zhǎng)至A600≈3，離心收集菌體，轉(zhuǎn)接于BMMY培養(yǎng)基中30,℃培養(yǎng)，以最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)．5,d后離心經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液上清液轉(zhuǎn)移至干凈的收集管中，沉淀用裂解緩沖液重懸后通過(guò)酸洗玻璃珠渦旋振蕩法進(jìn)行細(xì)胞破碎．分別取菌體培養(yǎng)液上清液及細(xì)胞破碎上清液，通過(guò)SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況．

2 結(jié)果與分析

2.1 膽固醇脫氫酶基因nvd-Bm的獲取及分析

來(lái)源于家蠶的膽固醇7，8–脫氫酶基因nvd-Bm(GenBank登錄號(hào)：AB232986.1)全長(zhǎng)為1,362,bp，GC含量為53.3%．依據(jù)表達(dá)宿主畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性，進(jìn)行該基因的密碼子優(yōu)化，改變了其中的335個(gè)堿基對(duì)，其GC含量由53.3%降低到52.9%，優(yōu)化后的基因序列見(jiàn)圖1．

NotⅠ和EcoRⅠ雙酶切的質(zhì)粒pUC57-nvd-Bm及pPIC9K的電泳圖如圖2所示．從圖2可以看出：泳道1的1.3,kbp片段、泳道2的9.3,kbp片段，分別與目標(biāo)基因nvd-Bm及pPIC9K預(yù)期結(jié)果相符合，表明已成功獲得目標(biāo)基因片段．

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pPIC9K-nvd-Bm的PCR驗(yàn)證電泳圖如圖3所示．由圖3可以看出：圖中的1.8,kbp片段，與pPIC9K-nvd-Bm菌液PCR預(yù)期結(jié)果相符合，表明目標(biāo)基因nvd-Bm已成功插入畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K中．取圖3中的pPIC9K-nvd-Bm重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示．圖4中均出現(xiàn)了1.3,kbp片段，進(jìn)一步表明目標(biāo)基因nvd-Bm已成功插入畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K中．選取圖4中驗(yàn)證正確的菌株交由公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)基因完全一致，表明重組表達(dá)載體pPIC9K-nvd-Bm構(gòu)建成功．

2.3 轉(zhuǎn)化畢赤酵母重組子的篩選和鑒定

含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母工程菌進(jìn)行基因組PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖5所示．圖5出現(xiàn)的1.8,kbp片段，與重組畢赤酵母GS115基因組PCR預(yù)期結(jié)果相符，表明目標(biāo)基因nvd-Bm均已成功整合至畢赤酵母GS115基因組中．

2.4 膽固醇7, 8–脫氫酶的表達(dá)

已構(gòu)建的含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母工程菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，分別收集菌體培養(yǎng)液上清液及沉淀．沉淀經(jīng)細(xì)胞破碎后，將菌體培養(yǎng)液上清液及細(xì)胞破碎上清分別經(jīng)蛋白電泳上樣緩沖液重懸煮沸進(jìn)行SDS-PAGE分析．結(jié)果如圖6所示．

由圖6可知：第2泳道，即含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母工程菌培養(yǎng)液在相對(duì)分子質(zhì)量約為6.4× 104的位置存在明顯的特異性條帶，由于轉(zhuǎn)錄翻譯起始于載體自身的起始密碼子，翻譯時(shí)會(huì)同時(shí)將載體上的起始密碼子至目標(biāo)基因的起始密碼子間的一段序列一并翻譯出，而該段氨基酸序列相對(duì)分子質(zhì)量約為1.3×104，故表達(dá)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量會(huì)比實(shí)際蛋白相對(duì)分子質(zhì)量5.1×104偏大，約為6.4×104，與預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量一致；另外，由于在畢赤酵母中表達(dá)的蛋白會(huì)受到不同程度的糖基化作用，因而電泳中觀測(cè)到的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量會(huì)比目標(biāo)蛋白出現(xiàn)不同程度的偏大．進(jìn)一步經(jīng)蛋白質(zhì)譜鑒定，證明其蛋白一級(jí)序列與目標(biāo)蛋白相符，表明目標(biāo)蛋白得到表達(dá)，表達(dá)量較高．

3 討 論

化學(xué)法合成7–脫氫膽固醇的生產(chǎn)工藝一般需要4步合成反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率為62%左右，反應(yīng)途徑長(zhǎng)、副產(chǎn)物多、反應(yīng)條件不易控制[13]．生物轉(zhuǎn)化法具體高效、綠色的特性，使其成為許多化學(xué)藥物和醫(yī)藥中間體化學(xué)合成工藝的替代技術(shù)[14]．

目前雖已有關(guān)于基因nvd-Dm在大腸桿菌中表達(dá)的相關(guān)報(bào)道，但由于其未依據(jù)大腸桿菌的偏愛(ài)性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，故表達(dá)效率偏低．另外，由于目標(biāo)基因來(lái)自于昆蟲(chóng)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)錄翻譯更適合在真核表達(dá)體系中進(jìn)行．本研究對(duì)獲得的膽固醇7，8–脫氫酶基因nvd-Bm(GenBank登錄號(hào)：AB232986.1)于畢赤酵母中進(jìn)行了外源表達(dá)，并依據(jù)畢赤酵母偏愛(ài)性進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的基因與黃時(shí)海等[11]于大腸桿菌中進(jìn)行的外源表達(dá)相比，有效地提高了膽固醇7，8–脫氫酶Nvd-Bm的表達(dá)效率．本研究還構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPIC9K-nvd-Bm，并通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法，構(gòu)建了含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母GS115工程菌，SDSPAGE蛋白電泳分析表明，目標(biāo)蛋白Nvd-Bm均已成功表達(dá)，但均主要存在于胞內(nèi)．下一步工作可通過(guò)改造pPIC9K-nvd-Bm重組質(zhì)粒信號(hào)肽序列引導(dǎo)目標(biāo)蛋白高效胞外分泌，進(jìn)一步提高其分泌表達(dá)量．此外，7，8–脫氫酶的基因組成目前尚不清晰，僅獲得其編碼基因表達(dá)蛋白，往往難以表現(xiàn)出酶活性．因此本課題組將進(jìn)一步研究其與伴侶蛋白的共表達(dá)，為膽固醇7，8–脫氫酶的活性檢測(cè)奠定基礎(chǔ)．

［1］ 王國(guó)海，梁亞麗，杜全宇. 兒童佝僂病的防治研究進(jìn)展

[J]. 現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)，2010，36(1)：3–4.

［2］ Jones G，Strugnell S A，De Luca H F. Current understanding of the molecular actions of vitamin D[J]. Physiological Reviews，1998，78(4)：1193–1231.

［3］ 楊蓉，包玉倩. 維生素D與肥胖的研究進(jìn)展[J]. 上海醫(yī)學(xué)，2011，34(11)：893–896.

［4］ 楊德智，魏時(shí)來(lái)，李發(fā)弟. 維生素D生理功效研究進(jìn)展[J]. 廣東飼料，2012，21(7)：23–26.

［5］ Holick M F，Chen T C，Lu Z，et al. Vitamin D and skin physiology：A D-lightful story[J]. Journal of Bone and Mineral Research，2007，22(S2)：28–33.

［6］ Yamanaka N，Hua Y J，Mizoguchi A，et al. Identification of a novel prothoracicostatic hormone and its receptor in the silkwormBombyx mori[J]. The Journal of Biological Chemistry，2005，280：14684–14690.

［7］ Yoshiyama T，Namiki T，Mita K，et al. Neverland is an evolutionally conserved Rieske-domain protein that is essential for ecdysone synthesis and insect growth[J]. Development，2006，133(13)：2565–2574.

［8］ 夏小斌，吳孔陽(yáng)，李湘萍，等. 生物法合成7–脫氫膽固醇研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技，2009，30(11)：339–342.

［9］ Capyk J K，D'Angelo I，Strynadka N C，et al. Characterization of 3-ketosteroid 9α-hydroxylase，a Rieske oxygenase in the cholesterol degradation pathway of Mycobacterium tuberculosis[J]. The Journal of Biological Chemistry，2009，284：9937–9946.

［10］ 黃時(shí)海，李湘萍，吳孔陽(yáng)，等. 7，8–脫氫酶基因的克隆與表達(dá)：中國(guó)，200910113933. 0[P]. 2009–03–24.

［11］ 薩姆布魯克 J，拉塞爾D W. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].黃培堂，譯. 3版. 北京：科學(xué)出版社，2002：1595–1601.

［12］ 趙翔，霍克克，李育陽(yáng). 畢赤酵母的密碼子用法分析[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2000，16(3)：308–311.

［13］ 查娟，高啟楠，張丹丹，等. 7–脫氫膽固醇的合成工藝研究[J]. 紹興文理學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，29(10)：33–35.

［14］ Yoshiyama-Yanagawa T，Enya S，Shimada-Niwa Y，et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme[J]. The Journal of Biological Chemistry，2011，286：25756–25762.

責(zé)任編輯：周建軍

Expression of the Protein Related to Cholesterol 7，8-Dehydrogenation

TANG Rui，SHEN Yanbing，GE Rile，NIU Dandan，WANG Min
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Bombyx moriNvd-Bm protein is associated with cholesterol 7，8-dehydrogenase. Based on DNA sequence encoded cholesterol 7，8-dehydrogenase reported on the NCBI(GenBank：AB232986.1)，cholesterol 7，8-dehydrogenase gene was cloned fromBombyx mori. Through codon optimization，cholesterol 7，8-dehydrogenase gene was obtained and the optimized gene was cloned into a yeast expression vector. Heterologously expressed target gene inP. pastorisGS115 resulted in the creation of engineeredP. pastorisGS115 / pPIC9K-nvd-Bm strains. Expression of the target protein in the engineeredP. pastorisGS115 / pPIC9K-nvd-Bm strains was demonstrated by SDS-PAGE. This study provided a foundation for the biological synthesis of 7-dehydrocholesterol.

Bombyx mori；cholesterol 7，8-dehydrogenase；codon optimization；Pichia pastoris；induced expression

Q812

A

1672-6510(2014)06-0027-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.006

2014–01–10；

2014–05–08

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)資助項(xiàng)目(2011AA02A211)

湯 睿（1989—），女，河北人，碩士研究生；通信作者：王 敏，教授，minw@tust.edu.cn.