羥基喜樹堿10，20位雙取代衍生物的合成及活性評價

郭 娜，江 都，溫少鵬，滕玉鷗

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

羥基喜樹堿10，20位雙取代衍生物的合成及活性評價

郭 娜，江 都，溫少鵬，滕玉鷗

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

根據喜樹堿類藥物的構效關系和前藥設計理念，設計和合成了一系列新的10，20位雙氨基甲酸酯取代的羥基喜樹堿衍生物，且均為新化合物．體外細胞活性測試結果表明：這些化合物的細胞毒作用比喜樹堿明顯降低，可作為前藥先導物進行更深入研究．

喜樹堿；抗腫瘤；合成

喜樹堿和羥基喜樹堿是從喜樹中分得的微量生物堿類化合物[1]，對多種腫瘤具有明顯的抑制作用，其作用靶點是拓撲異構酶I(TopoI)．喜樹堿和羥基喜樹堿具有較強毒副作用，容易出現不良反應，同時溶解性差，因此國內外研究者一直致力于尋找高效低毒的喜樹堿衍生物，希望可以使藥物選擇性地分布于腫瘤部位，從而減少對正常細胞的毒性，或者因安全性提高使得用藥量以及用藥次數增加[2–3]．達到上述目的的方法之一是以前藥的形式將藥物制作成相對非毒性的制劑，待藥物到達腫瘤部位時再被激活生成活性形式．

喜樹堿常見的另一問題是其20位羥基內酯的不穩定性，在中性至堿性條件下容易水解開環成為非活性的羧酸鹽．已有構效關系表明，內酯環與20位裸露的羥基是該類化合物抗腫瘤活性所必需的結構特征，將20位羥基衍生化后會導致活性下降，但同時內酯環的穩定性增加[4]，這是因為20位羥基可以與內酯的羰基基團形成分子內氫鍵，加速內酯的水解，而20位衍生化后破壞了此氫鍵作用，從而使內酯結構穩定．因此，20位進行適當的衍生化是制備喜樹堿前藥最普遍的方法[5–7]．最常見的衍生化是將20位羥基成酯[8–9]，但酯基在生理pH條件下容易水解，同時體內的多種水解酶也可水解酯基，選擇性差，因此不是制備前藥的理想基團．

2004年，Pessah等[10]報道了一系列喜樹堿20位氨基碳酸酯連接橋連接的衍生物，該連接橋可被青霉素G酰化酶或催化抗體38C2選擇性去除，釋放出原藥．因此，該連接橋在前藥研究中具有較好的應用前景，本文研究也正是采用了氨基甲酸酯這一連接橋．

由于羥基喜樹堿比喜樹堿毒性稍小，抗瘤譜更

廣，因此本文選擇羥基喜樹堿為原藥，在其10位、20位同時以氨基甲酸酯為連接橋連接不同的親水含氮基團，目的是通過對羥基喜樹堿雙取代的修飾在形成前藥的同時獲得比20位單取代衍生物更好的水溶性.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

羥基喜樹堿，化學純，上海龍翔醫藥科技有限公司；對硝基氯甲酸苯酯等試劑，化學純，國藥化學試劑有限公司．

6120型高效液相–質譜聯用儀(LC-MS)，安捷倫科技有限公司；AV–400型核磁共振儀，布魯克光譜儀器公司．

1.2 合成方法

羥基喜樹堿的10位、20位均有羥基官能團，但反應活性不同，10位羥基的反應活性高于20位，控制反應條件和試劑當量可以選擇性地在10位發生反應，在增加試劑當量或反應條件劇烈的情況下可以得到10，20位雙取代的產物．據此，設計了一條簡便易行的合成路線合成目標化合物，見圖1．

1.2.1 中間體的合成

取5,g(13.72,mmol)10–羥基喜樹堿溶于500,mL無水二氯甲烷(DCM)中，于冰浴下加入16.77,g (137.2,mmol)4–二甲氨基吡啶(DMAP)，再加入16.6,g(82.34,mmol)對硝基氯甲酸苯酯，冰浴下攪拌15,min，在室溫下反應10,h．TLC檢測反應完全后，用300,mL飽和氯化鈉水溶液洗滌3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，加入乙醚使產物析出，過濾，干燥，得8.1,g 10，20–二(4–硝基碳酸苯酯)–喜樹堿，即化合物1．

1.2.2 目標產物的合成

取0.5,g(0.72,mmol)10，20–二(4–硝基碳酸苯酯)–喜樹堿(化合物1)溶于3,mL無水二甲基甲酰胺(DMF)，冰浴下加入0.22,mL(2.88,mmol)正丙胺，攪拌．TLC監測反應完全后，向反應混合物中加入15,mL飽和氯化鈉水溶液，用25,mL二氯甲烷萃取3次，合并有機相，有機相用飽和氯化鈉水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，V(二氯甲烷)∶V(甲醇)＝175∶1，200目硅膠柱層析純化，得0.19,g固體化合物2．

化合物3—化合物6的合成方法與化合物2相同，只是含氮試劑分別為正丁胺、二乙胺、四氫吡咯和嗎啉．

1.3 活性測試

采用MTT法檢測目標化合物(化合物2—化合物6)和中間體(化合物1)對HepG2(人肝癌細胞)、K562(人白血病細胞)和HT-29(結腸癌細胞)3種腫瘤細胞的生長抑制活性．

2 結果與討論

2.1 化合物的表征數據

2.1.1 化合物1

ESI-MS(m/z)：693.4[M–H]-.1H NMR(d6-DMSO，400,MHz)，δ：0.955～0.991(m，3,H)，2.249～2.329 (m，2,H)，5.338(s，2,H)，5.569(d，J＝6.0,Hz，2,H)，7.293(s，1,H)，7.529(d，J＝9.2,Hz，2,H)，7.769(d，J＝9.2,Hz，2,H)，7.971～8.001(m，1,H)，8.215(d，J＝2.4,Hz，1,H)，8.278～8.321(m，3,H)，8.395(d，J＝9.2,Hz，2,H)，8.754(s，1,H).

2.1.2 化合物2

ESI-MS(m/z)：533.6[M–H]-.1,H NMR(d6-DMSO，400,MHz)，δ：0.711～0.810(m，3,H)，0.845～0.935 (m，6,H)，1.332～1.386(m，2,H)，1.497～1.551(m，2,H)，2.058～2.128(m，2,H)，2.828～2.891(m，2,H)，3.056～3.105(m，2,H)，5.305(s，2,H)，5.436(d，J＝3.2,Hz，2,H)，7.024(s，1,H)，7.629～7.657(m，1,H)，7.764～7.792(m，1,H)，7.891(d，J＝2.4,Hz，1,H)，7.979～8.007(m，1,H)，8.175(d，J＝9.2,Hz，1,H)，8.662(s，1,H).

2.1.3 化合物3

ESI-MS(m/z)：561.3[M–H]-.1,H NMR(d6-DMSO，400,MHz)，δ：0.711～0.815(m，3,H)，0.891～0.937 (m，6,H)，1.2～1.251(m，2,H)，1.294～1.383(m，4,H)，1.460～1.515(m，2,H)，2.052～2.123(m，2,H)，2.890～2.905(m，2,H)，3.091～3.140(m，2,H)，5.307(d，J＝3.2,Hz，2,H)，5.435(d，J＝2.4,Hz，2,H)，7.021(s，1,H)，7.626～7.654(m，1,H)，7.739～7.767 (m，1,H)，7.885(d，J＝2.4,Hz，1,H)，7.948～7.976 (m，1,H)，8.164(d，J＝9.2,Hz，1,H)，8.66(s，1,H). 2.1.4 化合物4

ESI-MS(m/z)：561.4[M–H]-.1,H NMR(CDCl3，400,MHz)，δ：0.973～1.010(m，3,H)，1.063～1.098 (m，3,H)，1.237～1.271(m，4,H)，1.306～1.374(m，6,H)，2.104～2.157(m，1,H)，2.241～2.312(m，1,H)，3.209～3.262(m，2,H)，3.399～3.577(m，6,H)，5.270(d，J＝6.0,Hz，2,H)，5.398(m，1,H)，5.676(d，J＝13.6,Hz，1,H)，7.357(s，1,H)，7.655～7.738(m，1,H)，8.274(d，J＝9.2,Hz，1,H)，8.350(s，1,H).

2.1.5 化合物5

ESI-MS(m/z)：557.5[M–H]-.1,H NMR(CDCl3， 400,MHz)，δ：0.958～0.995(m，3,H)，1.846～1.896(m，2,H)，1.946～2.045(m，6,H)，2.104～2.158(m，1,H)，2.269～2.323(m，1,H)，3.23～3.275(m，1,H)，3.353～3.397(m，1,H)，3.522～3.555(m，2,H)，3.617～3.663(m，4,H)，5.206～5.318(m，2,H)，5.407(d，J＝13.2,Hz，1,H)，5.67(d，J＝17.2,Hz，1,H)，7.343(s，1,H)，7.649(m，1,H)，7.758(d，J＝2.0,Hz，1,H)，8.248(d，J＝9.2,Hz，1,H)，8.343(s，1,H).

2.1.6 化合物6

ESI-MS(m/z)：589.4[M–H]-.1,H NMR(CDCl3，400,MHz)，δ：0.969～1.006(m，3,H)，2.108～2.319(m，2,H)，3.345～3.452(m，2,H)，3.485(s，4,H)，3.644(s，4,H)，3.765～3.813(m，6,H)，5.286(t，J＝5.6,Hz，2,H)，5.406(d，J＝13.2,Hz，1,H)，5.683(d，J＝17.2,Hz，1,H)，7.303(s，1,H)，7.657(m，1,H)，7.734(d，J＝2.4,Hz，1,H)，8.263(d，J＝8.8,Hz，1,H)，8.356(s，1,H).

2.2 活性測試結果

采用MTT法測定中間體(化合物1)和目標產物(化合物2—化合物6)的體外抑制腫瘤細胞生長活性，結果見表1．由表1可見：化合物1—化合物6的活性均顯著低于喜樹堿，這與20位的羥基為活性必需的結論是相符的，同時也說明這些化合物符合前藥的基本要求；中間體的抑制活性高于其他化合物，可能是由于中間體的穩定性差，在測試體系中有部分已變回羥基喜樹堿；化合物4—化合物6的體外活性的降低較為明顯，因此初步判斷它們更適合繼續進行藥理和藥代動力學研究，例如動物急毒實驗、動物腫瘤抑制效果評價等．

2.3 目標產物的脂水分配系數

在實驗過程中，觀察到目標產物在水和有機溶劑中的溶解性相對喜樹堿和羥基喜樹堿均有所改善.

使用Chemdraw Ultra 8.0軟件對化合物2—化合物6的脂水分配系數(CLogP)進行了預測，結果見表2．可以看出：化合物2—化合物5的脂溶性明顯增強，而化合物6的性質與喜樹堿和羥基喜樹堿相當．所有目標產物的CLogP均小于5，符合Lipinski五規則，可以預期該類化合物可能具有更好的理化性質．

3 結 語

本文在喜樹堿類藥物已有構效關系的基礎上，選擇上市藥物伊立替康中的氨基甲酸酯連接橋設計和合成了一系列10，20位雙取代的喜樹堿類衍生物，該類化合物的脂溶性有所改善，同時體外活性測試結果表明這些衍生物細胞毒作用明顯降低，可作為前藥先導物進一步研究．

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責任編輯：常濤

Synthesis and Biological Evaluation of 10，20-Disubstituted Hydroxycamptothecin Derivatives

GUO Na，JIANG Du，WEN Shaopeng，TENG Yuou
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

According to the structure-activity relationship(SAR)of camptothecin and the concept of prodrug，a novel seires of 10，20-disubstituted camptothecin derivatives with a carbamate linker was designed and synthesized. Biological evaluation in vitro revealed that the cytotoxicity of these analogs was significantly reduced compared with camptothecin，which indicated that these compounds could be further investigated as lead prodrugs.

camptothecin；antitumor；synthesis

R914.5

A

1672-6510(2014)06-0007-04

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.002

2014–04–01；

2014–05–19

國家自然科學基金資助項目(81302649)；天津市自然科學基金資助項目(14JCQNJC13200)

郭 娜（1982—），女，河北人，助理研究員；通信作者：滕玉鷗，副教授，tyo201485@tust.edu.cn.