大鼠血漿中10-羥基喜樹堿含量測(cè)定方法

李思陽(yáng)

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)藥與健康管理系，江蘇 淮安 223003）

大鼠血漿中10-羥基喜樹堿含量測(cè)定方法

李思陽(yáng)

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)藥與健康管理系，江蘇 淮安 223003）

實(shí)驗(yàn)旨在建立大鼠血漿中10-羥基喜樹堿含量的測(cè)定方法。通過(guò)高效液相色譜熒光檢測(cè)HCPT和CPT的含量，建立了大鼠血漿中HCPT的濃度（X）與HCPT的峰面積和CPT的峰面積之比（Y）的線性回歸方程以及回歸系數(shù)。HCPT和CPT均可與血漿中的其他成分較好地分離，血藥濃度在6.25～400 ng·mL－1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸系數(shù)為0.9988。這種方法重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)便，適用于血濃度檢測(cè)。

羥基喜樹堿；喜樹堿；高效液相色譜；血漿

喜樹堿（camptothecin，CPT）是1966年由Wall等［1，2］從我國(guó)特有的珙桐科植物喜樹Camptotheca acuminata Decne中分離得到的一種吲哚類生物堿，具有顯著的廣譜抗腫瘤活性［3，4］。10-羥基喜樹堿（10-hydroxycamptothecin，HCPT）作為喜樹堿的天然衍生物，是我國(guó)臨床應(yīng)用的喜樹堿類抗腫瘤藥物。目前已經(jīng)有文獻(xiàn)［5－8］報(bào)道檢測(cè)血漿中HCPT含量的高效液相色譜法，但一般使用紫外檢測(cè)器并采用外標(biāo)法定量，靈敏度和準(zhǔn)確度較低。本研究使用熒光檢測(cè)器，以CPT為內(nèi)標(biāo)，以乙醚為萃取溶劑制備樣品，嘗試一種選擇性好、靈敏度高的測(cè)定大鼠血漿中HCPT濃度的高效液相色譜法，為進(jìn)一步研究HCPT的藥代動(dòng)力學(xué)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑

CPT、HCPT：甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純，購(gòu)于哈爾濱峰源高科技開發(fā)有限公司。

1.2 動(dòng)物

潔凈級(jí)大鼠，體重200 g左右，購(gòu)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 儀器

高效液相色譜系統(tǒng)，包括1525型二元泵、717型自動(dòng)進(jìn)樣器、2475型熒光檢測(cè)器：美國(guó)Waters公司；Sorvall Legend Micro17型離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司；H-H-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；WH-986靜音混合器和WH-861漩渦混合器：江蘇省太倉(cāng)市科教器材廠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 血漿樣品的采集

從大鼠心臟取血，置于2 mL肝素化試管，4000 r·min－1離心30 min，取上清液，－80℃冷凍保存。

2.2 溶液的制備

精密稱取HCPT、CPT各1 mg，分別用甲醇溶解，定容至25 mL，得到濃度為40μg·mL－1貯備液，分裝，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)時(shí)，用甲醇將HCPT貯備液稀釋成濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、200、400 ng·mL－1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇將CPT貯備液稀釋成濃度為200 ng·mL－1的溶液作為內(nèi)標(biāo)溶液，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 色譜條件

色譜柱：Luna C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流速：1.2 mL·min－1；熒光檢測(cè)器檢測(cè)；激發(fā)波長(zhǎng)：383 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：553 nm；流動(dòng)相：水（A）-甲醇（B），采用梯度洗脫。

2.4 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

取甲醇、空白血漿＋HCPT＋內(nèi)標(biāo)，按“2.3”項(xiàng)

中色譜條件進(jìn)樣分析，檢測(cè)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)與待測(cè)組分的分離度。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取空白血漿100μL，依次加入內(nèi)標(biāo)溶液、HCPT系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和1％冰乙酸各100μL，再加入乙醚約700μL，將混合液渦旋1 min、靜音混合60 min后，13000 r·min－1離心20 min，取上清液重復(fù)萃取1次，合并上清液置于干凈的離心管中，40℃水浴，空氣流吹干，最后用甲醇200μL溶解，12000 r·min－1離心5 min，取上清液50μL進(jìn)樣。以HCPT標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（c）為橫坐標(biāo)，HCPT峰與CPT峰面積之比（A）為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸分析。

2.6 方法回收率與精密度實(shí)驗(yàn)

按“2.2”項(xiàng)中方法制備低、中、高濃度的HCPT質(zhì)控樣品溶液，按“2.5”項(xiàng)中方法處理后進(jìn)樣，每天連續(xù)測(cè)定6次；每天對(duì)低、中、高濃度的溶液各測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定6 d，隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算方法回收率及日內(nèi)、日間精密度。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 色譜條件的確定

經(jīng)過(guò)對(duì)高效液相色譜條件的摸索，確定了梯度洗脫條件，詳見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件

3.2 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別將色譜級(jí)甲醇、以CPT為內(nèi)標(biāo)物的HCPT注入高效液相色譜，來(lái)檢測(cè)溶劑對(duì)本實(shí)驗(yàn)是否有干擾以及CPT和HCPT的分離程度。其色譜圖分別見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 甲醇的空白色譜圖

圖2 以CPT為內(nèi)標(biāo)物的HCPT在血漿中的色譜圖

從圖1和圖2可以看出，甲醇試劑并沒(méi)有對(duì)CPT和HPCT的分離產(chǎn)生影響，此外，在“2.3”項(xiàng)中，CPT與HCPT能夠有效地分離，峰形良好，其保留時(shí)間分別為11.34 min和10.58 min。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖3可知，HCPT濃度在6.25～400 ng/mL－1時(shí)線形關(guān)系良好，實(shí)驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)單，方便易行，穩(wěn)定性好，適用于血藥濃度研究。

3.4 方法回收率與精密度實(shí)驗(yàn)

由表2結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)方法回收率較高，相對(duì)誤差小，相對(duì)校準(zhǔn)偏差較小，證明實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確、可靠。

圖3 HCPT系列濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 方法回收率與精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

4 結(jié)論

CPT和HCPT均為水不溶性物質(zhì)，但化學(xué)結(jié)構(gòu)中E環(huán)閉合的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)在堿性條件下可開環(huán)形成可溶于水的羧酸鹽形式，因此在分析樣品中加入1％乙酸，以保證其E環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)處于閉合狀態(tài)。

比較了不同梯度洗脫和等度洗脫條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，結(jié)果表明，梯度洗脫峰形優(yōu)于等度洗脫，在選定的梯度洗脫條件下HCPT和內(nèi)標(biāo)與雜質(zhì)均可實(shí)現(xiàn)良好分離，并可去除色譜柱中殘留的脂溶性雜質(zhì)，提高色譜柱的使用壽命。此外，使用甲醇與水混合作流動(dòng)相既降低了成本又減少了試劑的毒性，達(dá)到了預(yù)期的實(shí)驗(yàn)效果。

使用不同的有機(jī)溶劑萃取樣品，經(jīng)過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，乙醚的萃取效果相對(duì)較好，故本實(shí)驗(yàn)采用乙醚作為有機(jī)溶劑對(duì)樣品進(jìn)行處理，制備樣品。

本實(shí)驗(yàn)主要探索大鼠血漿中HCPT含量的測(cè)定方法，這種方法簡(jiǎn)單有效，能夠?qū)崿F(xiàn)CPT和HCPT的良好分離，這些結(jié)果可為以后更好地研究HCPT在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)提供理論依據(jù)。

［1］Wall M E，Wani M C，Cook C E，etal.Plant Antitumor Agents.I.The Isolation and Structure of Camptothecin，a Novel Alkaloidal Leukemia and Tumor Inhibitor from Camptotheca Acuminata［J］.J Am Chem Soc，1966，88（16）：3888－3890.

［2］黃瑞松，葉云鋒，梁?jiǎn)⒊桑?HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地喜樹果中喜樹堿［J］.中草藥，2009，40（1）：137－140.

［3］Hsiang Y H，Hertzberg R，Hecht S，etal.Camptothecin Induces Protein-linked DNA Breaks Via Mammalian DNA Topoisomerase I［J］.J Biol Chem，1985，260（27）：14873－14878.

［4］謝峻，談鋒.植物來(lái)源抗腫瘤藥物研究進(jìn)展［J］.中草藥，2007，38（2）：285－289.

［5］吳映蓉，張燦珍.測(cè)定小鼠血漿及組織中羥基喜樹堿濃度的研究［J］.中國(guó)藥業(yè)，2002，11（9）：30－32.

［6］楊元?jiǎng)祝瑥埦ЬВ顟c平.羥喜樹堿注射液在小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究［J］.藥學(xué)服務(wù)與研究，2007，7（3）：209－212.

［7］葉孟，潘宏銘，李楠，等.羥基喜樹堿兩種不同給藥途徑的藥動(dòng)學(xué)研究［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，36（6）：531－534.

［8］胡婧，劉松青.羥基喜樹堿緩釋片在大鼠腦內(nèi)的釋放情況研究［J］.中國(guó)藥房，2012，23（9）：797－799.

［責(zé)任編輯：陳曙娟］Development of a M ethod for HCPT Determ ination in Rat Plasma

LISi-yang
（Department of Medicine and Health Management，Jiangsu Food and Pharmaceutical Science College，Huai'an 223003，Jiangsu，China）

This experimentaims at developing amethod for determining 10-OH camptothecin content in rat plasma.Detecting the content of HCPT and CPT by using high performance liquid chromatography（HPLC）with fluorescence，this experiment establishes the linear regression equation and regression coefficientsabout the concentration of HCPT（X）and the peak area of HCPT ratio to the peak area of CPT（Y），and acquire regression coefficient in rat plasma.The result shows that HCPT and CPT in plasma can be better separated from other components，the concentration of plasma shows good linear relationship in the range of6.25～400 ng/mL and regression coefficient is 0.9988.Thismethod is easy to operate，has good reproducibility，and can be used to investigate the blood concentration.

HCPT；CPT；HPLC；plasma

TQ460

A

1006－8481（2014）03－0037－03

2013－11－09

李思陽(yáng)（1987—），男，江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥與健康管理系講師，碩士。