中藥野艾揮發物抗菌活性與化學成分分離鑒定研究

任維華，李偉華

(萊蕪市人民醫院藥劑科，山東 萊蕪 271100)

野艾屬于菊科蒿屬草本植物，俗名苦艾、野艾蒿等，是我國的傳統中藥，其性涼、味苦、辛，富含揮發油，有特殊香味，具有抗菌消炎、抗病毒、止咳止血、抗過敏等作用[3]。在我國分布范圍較廣，常見于荒野、草地、林邊及丘陵地帶，也有部分人工種植。本研究對野艾揮發油進行提取分離和成分鑒定，并研究其對微生物的殺滅抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

原材料野艾購于深圳福田中醫院，產地廣東，超臨界萃取裝置、氣相色譜-質譜聯用儀等均為國內研發制作。試驗所用蒸餾水均采用自動雙重純水蒸餾器制作，菌株均來自武漢大學的菌種保藏中心，實驗采用牛肉汁蛋白胨培養基(NA：酵母浸膏1 g，牛肉浸膏4 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，瓊脂15 g，水1 L，pH7.0，121℃滅菌 30 min)培養。

1.2 方法

1.2.1 揮發油提取 萃取法[1]：①將收集的野艾地上部分洗凈陰干切碎稱重為8.9 kg，裝入萃取裝置；②萃取裝置溫度設置為35 ℃，排除裝置中的空氣；③打開壓縮機，調節儀器內部壓強保持在16 MPa，調節錯誤未找到引用源。出口閥，保存20 kg/h；持續80 min，打開分離器，取出萃取物；④關閉萃取裝置，取出揮發油粗制提取物，然后放入2倍的無水乙醇攪拌均勻，靜止24 h；⑤真空抽濾，再除去蠟質沉淀物，最后將濾液在30°回收乙醇，得到精制野艾揮發油。

1.2.2 抑菌圈測定 實驗對野艾揮發油的抑菌效果測定使用的是濾紙片瓊脂平板擴散法。首先，在3個固體平板均勻涂上牛肉汁蛋白胨培養液；其次，取已滅菌的濾紙片(7 mm)黏取約15 μL，將已稀釋好的揮發油樣品置于平板上，每個菌種取6個平行組；最后放入培養箱中培養，細菌組溫度為36° 24 h，真菌組溫度為27° 48 h，并測算菌落直徑3次求取平均值，以左旋氧氟沙星為對照。

1.2.3 MIC和MBC的測定 采用稀釋法對最低殺菌濃度MCI和最低抑菌濃度MBC進行測定。在96孔平板上涂上液體培養基接種菌落，再加入已稀釋好的各濃度揮發油樣品，放入培養箱中培養，細菌組溫度為36°24 h、真菌組溫度為27°48 h后觀察，每個菌種的每個揮發油樣品相同稀釋度的實驗各3組，重復2次。MIC的確定標準[5]：肉眼無法觀察到培養基內培養物渾濁的樣品為最低抑菌濃度。MBC的確定標準：首先是取出培養后無渾濁的平板再培養，以再培養后平板無菌落生成為最低樣品的抑制濃度，并以左旋氧氟沙星為對照。

1.2.4 使用質譜聯用儀對野艾揮發油進行化學成分分離鑒定 首先，將揮發油樣品以1∶5的比例溶于乙酸乙酯，搖勻分流進樣。鑒定分以下兩部分：①色譜條件：色譜柱-25 m×0.25 mm，柱溫-前2 min保持45℃，再以5℃每分鐘的速度提高至100℃，保持2 min，再以10℃每分鐘提高到220℃.進樣量0.5 μL，流速1 mL·min-1,載氣He, 分流比30, He。采用歸一化法計算其相對的百分比含量；②質譜條件：進物口溫度220℃，EL電離方式，電離電壓為70 EV，離子源溫度為330℃，掃描范圍35～350 amu，各組成成分分子式通過NIST進行檢索。

1.3 統計學方法

采用SPSS及EXCEL等軟件進行統計分析,實驗通過反復統計分析所得。

2 結果

2.1 野艾揮發油的主要成分

經氣相色譜分離出揮發油中的39種成分，經質譜圖NIST檢索確認，再用面積歸一化法分析其各自的相對含量，其余成分因各種原因未能確認。表1顯示，野艾揮發油的主要5種成分分別為蒿酮15.52%、蒿醇9.63%、順式丁香烯8.71%、艾醇7.37%和桉葉素6.47%等。

表1 野艾揮發油 GC- MS 分析結果和化學成分

2.2 野艾揮發油對三類菌的抗菌效果

對革蘭氏陽性菌的抗菌效果相對較好,對真菌的效果一般，對革蘭氏陰性菌無效。

3 結論

實驗對野艾揮發油的化學成分研究采用了氣-質聯用的分析方法，首先通過使用超臨界錯誤，未找到引用源。萃取法對野艾揮發油進行分類提純鑒定，其次再使用氣相色譜對揮發油進行成分分離鑒定，查出揮發油中所含有的各化學成分組成，再利用歸一法測算揮發油中各化學成分的相對百分含量，最后再通過質譜聯用儀進行確定，采用NIST計算機分子庫進行自動檢索，確定揮發油中的各種化學成分及其含量。

表2 野艾揮發油對各種微生物的抗菌活性

注：DD,抑菌圈直徑(MM)；NA,無活性

對于野艾的殺菌抑菌研究也表明，野艾揮發油對測試菌種有較強的抑制和殺滅作用，尤其是對革蘭氏陽性菌的殺菌活性很強。在過往的研究中也曾有過類似的報道[2]，蒿酮、蒿醇和桉葉素對革蘭氏陽性菌有很強的殺滅作用，對部分真菌和革蘭氏陰性菌也有抑制作用?？梢钥闯?，這3種物質是野艾抗菌的物質基礎，野艾揮發油對幾種細菌的生長抑制作用會隨著揮發油濃度的提高而加強。

本文對揮發油抗菌活性的研究還利用了揮發油中芳香類化合物包括檸檬烯、蒎烯等的抗菌作用，尤其是萜類的化合物。有數據[4]顯示，芳香族化合物(如檸檬烯)的特點一是具有較強的香氣，二是具有較好的抗菌效果，三是具有較高的藥物成分，四是具有較大的生物活性，因此是制作生態抗病毒殺菌劑的合理材料。

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