中國漢族人群晚期糖化終產物受體基因-429T/C多態性對其mRNA和蛋白表達的影響研究

蔡 偉，徐積兄，張 微，朱偉鋒，朱凌燕，劉 盈，肖鈞仁，劉建英

許多研究表明，晚期糖化終產物受體(RAGE)對糖尿病慢性并發癥起著重要作用[1-3]。RAGE是一個多配體的細胞表面分子，屬于免疫球蛋白超家族。RAGE廣泛分布于血管內皮細胞、單核巨噬細胞、腎小球系膜細胞、神經膠質細胞等。而且，RAGE表達水平受高血糖等環境的影響，尤其是長期高血糖所致大量晚期糖化終產物(AGEs)存在的條件下，RAGE呈高水平表達[1]。RAGE通過與其配體AGEs等相互作用，參與了糖尿病血管病變的發生與發展過程[2-3]。本研究的前期研究及其他研究均發現，RAGE基因-429T/C多態性與中國漢族人糖尿病血管并發癥包括缺血性心臟病和腎病相關[4-5]。因而推測-429T/C多態性可能通過改變RAGE基因表達，從而影響RAGE在糖尿病血管并發癥中的作用。因此，本研究擬通過檢測不同基因型的糖耐量正常人外周血單核細胞(PBMC)RAGE的mRNA和蛋白表達水平，以初步了解RAGE基因-429T/C多態性對基因表達功能的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年8—12月在江西南昌地區糖尿病流行病學調查人群中，選取70名糖耐量正常的漢族人群作為研究對象，均經口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)篩查為糖耐量正常，排除糖尿病病史、高血壓病史、脂質代謝紊亂史，無糖尿病家族史，而且血壓、血脂和肝腎功能均正常。最終匹配選取TT基因型組11名和TC基因型組11名。兩組性別、年齡、體質指數、血壓、空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c)水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表1)。本研究通過了南昌大學第一附屬醫院醫學研究倫理委員會審查批準，并取得了受試者的知情同意。

1.2 材料 DNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，人單核細胞分離液購自TBD公司，總RNA提取試劑盒購自Transgen公司，兔抗人RAGE抗體和羊抗兔-HRP購自Santa Cruz公司，隨機引物和反轉錄酶購自美國Promega公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 PBMC提取與分離 抽取早晨空腹外周靜脈血2 ml，按1∶1體積加入Hank′s液混勻后，小心緩慢地在其液面上加入2 ml細胞分離液，以2 000 r/min(離心半徑145 mm)離心15 min，收集液界面上的細胞，放入含Hank′s液5 ml的試管中充分混勻后，以2 000 r/min(離心半徑145 mm)離心10 min，吸去上清液，沉淀經反復洗2次后，收集細胞備用。

1.3.2 基因型檢測 使用DNA提取試劑盒提取樣本基因組DNA，然后進行目的基因片段的PCR擴增。PCR產物總長為344 bp，上游引物：5′-GGGGGCAGTTCTCTCCTC-3′，下游引物：5′-TCAGAGCCCCCGATCCTATTT-3′。PCR反應條件[5]：先預變性94 ℃ 10 min，繼之變性94 ℃ 30 s，退火62 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，接著每個循環的退火溫度依次下調0.5 ℃，共12個循環；其后變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共30個循環；最后延伸72 ℃ 15 min。PCR擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行直接測序，以確定RAGE基因-429T/C多態性的基因型。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測RAGE mRNA表達水平 提取各組總RNA(按照試劑盒說明書操作)，核酸蛋白分析儀檢測含量。以隨機引物法合成cDNA，以cDNA為模板采用Taqman探針法進行實時熒光定量PCR。RAGE引物序列上游引物：5′-GGGCTCTTCACACTGGC-3′，下游引物：5′-CTCCAGTACTACTCTCTGCCTGC-3′；Taqman探針序列為：5′-CGACAAGCACGCTTAGTTGACGGC 3′( 5′標記為FAM，3′標記為TAMRA)。GAPDH引物序列上游引物：5′-CAGTCAGCCGCATCTTCCTTT-3′,下游引物：5′-GTGACCACGGGCCAATAC-3′；Taqman探針序列為：5′-CGTCGCCAGCGGAGCCACA-3′(5′標記為FAM，3′標記為TAMRA)。采用Applied Biosystems公司7300 實時熒光定量PCR檢測系統進行擴增反應并讀取試驗數據。PCR反應條件：預變性95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。利用RAGE mRNA/GAPDH mRNA評定各標本RAGE mRNA表達水平。

1.3.4 Western blotting法檢測RAGE蛋白表達 每個樣本PBMC加入細胞裂解液100 μl，在4 ℃溫度下裂解30 min，離心后取上清液進行蛋白含量的測定。配制8%分離膠與5%濃縮膠，上述每組蛋白取約30 μg加入等體積蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，進行聚丙烯酰胺電泳，隨后轉移到硝酸纖維膜上，與特異性第一抗體(1∶200稀釋)、第二抗體(1∶1 000稀釋)結合，最后利用Luminol Reagent發光顯色。以GAPDH作為內參照，結果以RAGE與GADPH光密度比值表示。

表1 兩組研究對象一般資料比較

注：HbA1c=糖化血紅蛋白；*為χ2值

2 結果

2.1 個體樣本-429T/C多態性基因型檢測結果 對70名糖耐量正常的健康人進行了DNA提取與PCR擴增，對PCR擴增產物進行測序，獲得了個體的RAGE基因-429T/C多態性的基因型，包括TT基因型57名和TC基因型13名(見圖1)。

圖1 RAGE基因-429T/C多態性基因型測序圖

Figure1 The genotype sequencing graph of RAGE gene -429T/C polymorphism

2.2 兩組RAGE mRNA表達水平 隨機數字表法選取TC基因型組11名，采用性別、年齡、體質指數、血壓、空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c相匹配的原則選擇TT基因型組11名。實時熒光定量PCR檢測結果顯示，TT基因型組RAGE mRNA表達水平(1.047±0.233)高于TC基因型組(0.740±0.209)，差異有統計學意義(t=2.42,P<0.05，見圖2)。

2.3 兩組RAGE蛋白表達水平 Western blotting檢測結果顯示，TT基因型組RAGE蛋白表達水平(1.121±0.252)高于TC基因型組(0.916±0.249)，差異有統計學意義(t=2.11,P<0.05,見圖3)。

3 討論

注：RAGE=晚期糖化終產物受體

圖2 兩組RAGE mRNA表達水平比較

Figure2 Comparison of RAGE mRNA expression levels between the two groups

圖3 兩組RAGE蛋白表達水平比較

在長期高血糖狀態下，糖尿病患者體內大量的RAGE配體AGEs形成和堆積[6]。AGEs通過結合并激活RAGE，繼而激發一些關鍵細胞信號傳遞途徑如MAP激酶(包括p38和p44/42 MAPK)和核因子кB(NF-кB)等，誘導氧化應激及炎性反應，促使糖尿病患者出現血管病變如動脈粥樣硬化、腎臟病變、視網膜病變等[3,7-8]。通過使用RAGE阻斷劑以及RAGE基因敲除，可明顯減緩或阻止糖尿病血管病變的發生與發展[9-10]。而且有證據提示，RAGE 與AGEs的相互作用也是導致糖尿病“代謝不良記憶效應”的重要原因之一[11-12]。由此可見，RAGE在糖尿病血管并發癥的發病過程中擔當重要角色。

本研究的前期研究發現，RAGE基因-429T/C多態性與中國漢族人糖尿病腎病相關，而且攜帶-429C等位基因者糖尿病腎病的發生風險更低[5]。這與香港Poon等[4]的研究結果相似，其研究表明攜帶-429C等位基因的中國人糖尿病腎病患者缺血性心臟病發生的風險更低。本研究檢測了-429T/C多態性不同基因型(TT基因型和TC基因型)的糖耐量正常人PBMC的RAGE表達情況，研究結果發現攜帶TT基因型者RAGE mRNA和蛋白表達水平高于攜帶TC基因型者，從而提示-429C等位基因可能降低RAGE基因表達活性，進一步支持-429C等位基因與糖尿病血管并發癥風險降低相關。然而，也曾有研究提示，攜帶-429C等位基因的白種人糖尿病視網膜病變發生風險更高，體外研究發現-429C等位基因和-374A等位基因明顯增強RAGE基因轉錄活性[13]。雖然造成以上結果的原因目前仍不明確，但目前認為可能原因：RAGE基因存在著明顯的種族差異性，不同的種族人群研究可能得出不同的結果，例如有研究包括筆者前期研究發現，中國漢族人RAGE基因-429T/C、 -374T/A和Gly82Ser多態性與白種人之間存在著明顯的種族差異性[14-15]；基因轉錄及蛋白的表達是一個復雜的過程，其中影響因素較多，而且體外和體內條件存在較大不同，因而得出的研究結果也可能不一致；RAGE在不同的環境下或在不同的組織細胞中所起的作用也存在差異。

總之，本研究結果提示，RAGE的遺傳變異性與RAGE基因表達相關，-429T/C多態性可能降低RAGE mRNA和蛋白表達水平，從而支持其與糖尿病血管并發癥的風險降低相關。由于本研究采用PBMC作為研究對象，而PBMC并不能完全模擬其他細胞包括血管內皮細胞的病理生理狀況，因而所得出的研究結果存在一定局限性。因此，今后將進行對血管內皮細胞和腎小球系膜細胞等不同細胞的研究，以進一步探討RAGE多態性的作用。

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