不同香煙煙霧暴露時間對大鼠肺組織樹突細胞數量的影響研究

曹 磊，平 芬，馬 錚，李 萍

煙草危害是人類健康最大的可以預防的危險因素，2012年我國原衛生部發布的《中國吸煙危害健康報告》[1]顯示，我國吸煙人群超過3億，約7.4億不吸煙人群遭受二手煙的危害，吸煙可以導致呼吸、心血管、消化、內分泌等多系統疾病，每年約有100萬人死于吸煙相關性疾病。吸煙致癌的機制被廣泛研究，但是其對免疫系統影響的研究卻較少。所以關于吸煙相關性疾病，不再僅強調其與癌癥、心血管疾病的關系，還應注意其對機體造成的免疫損傷以及免疫損傷后的反復感染。

樹突細胞(dendritic cells，DCs)是一種專職抗原提呈細胞(antigen-presenting cell，APC)，體內含量少，提呈作用超強，DCs能激活初始T細胞誘導機體的有效免疫應答，并決定免疫應答的方向，同時DCs在維持免疫耐受方面也具有重要作用[2]。其能提呈抗原，表達共刺激分子，分泌細胞因子，激活T、B淋巴細胞，產生免疫應答，是啟動獲得性免疫反應的關鍵因素[3]。本研究旨在觀察不同香煙煙霧暴露時間對大鼠DCs數量的影響，為吸煙相關性疾病的臨床治療及藥物研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 將清潔級雄性Wistar大鼠(購買于河北醫科大學實驗動物中心)50只，體質量(150±20)g，按照完全隨機化法分為空白對照組(A組，10只)和香煙煙霧暴露組(40只)，按照不同暴露時間將香煙煙霧暴露組又分為香煙煙霧暴露4周組(B組)、香煙煙霧暴露8周組(C組)、香煙煙霧暴露12周組(D組)和香煙煙霧暴露8周戒煙8周組(E組)，每組10只。

1.2 研究方法 將香煙煙霧暴露組大鼠放在自制有機玻璃熏煙箱內(60 cm×60 cm×90 cm)，每天熏煙2次(間隔時間>6 h)，每次點燃5支香煙(鉆石牌香煙，焦油量11.0 mg，煙氣煙堿量1.0 mg，煙氣一氧化碳量11.0 mg)放入有機玻璃熏煙箱內，燃燒15 min，休息5 min后再放入5支，每天點燃30支，持續2 h，香煙煙霧暴露間隔期間將大鼠置于正常無煙環境中飼養，任其自由采食、飲水。A組大鼠不熏煙，置于正常無煙環境中飼養。

1.3 取材 香煙煙霧暴露組大鼠分別在香煙煙霧暴露4周、8周、12周及香煙煙霧暴露8周戒煙8周后腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，腹主動脈放血處死，分離肺組織，取右肺中葉置于4%多聚甲醛固定液中保存24 h，常規石蠟包埋切片備用。A組大鼠16周后做相同處理。

1.4 DCs計數 以CD11c和S100蛋白作為大鼠支氣管肺組織DCs的標志物，采用免疫組化法染色切片，以胞質染成棕黃色或黃色為陽性細胞。每張切片隨機取10個高倍野(400倍)，使用IPP6軟件計數染色陽性細胞數，取其平均值即為該張切片的陽性細胞數，也即DCs數量。

2 結果

CD11c、S100蛋白陽性DCs均在支氣管管壁、炎癥區域、血管周圍分布明顯。5組CD11c、S100蛋白陽性DCs數量比較，差異有統計學意義(P<0.05)。B、C、D、E組CD11c、S100蛋白陽性DCs數量均高于A組，C、D組均高于B組，D組高于C組，E組低于C組，差異有統計學意義(P<0.05，見表 1，圖1～2)。

Table1 Comparison of the number of CD11c+and S100+DCs among five groups

組別例數CD11c陽性DCsS100陽性DCsA組108 6±0 98 4±0 8B組1010 1±0 8★10 3±1 1★C組1013 5±1 0★●12 9±1 6★●D組1014 6±1 1★●■14 2±1 7★●■E組1012 0±1 4★■11 6±1 4★■F值53 1427 41P值<0 001<0 001

注：與A組比較，★P<0.05；與B組比較，●P<0.05；與C組比較，■P<0.05；DCs=樹突細胞

圖1 5組大鼠肺內CD11c陽性DCs分布(免疫組化法，×400)

圖2 5組大鼠肺內S100蛋白陽性DCs分布(免疫組化法，×400)

3 討論

吸煙可以導致呼吸、心血管、消化、內分泌等多系統疾病，肺部有巨大的表面積、豐富的血流，如與香煙煙霧直接接觸，會成為首當其沖的受害器官[4]。香煙煙霧暴露使肺組織局部巨噬細胞凋亡[5]，中性粒細胞激活、聚集，炎性遞質釋放[6]，肺毛細血管壁通透性升高，從而導致出血及間質性肺水腫。肺部DCs在維持肺臟免疫平衡中起著非常重要的作用。肺部DCs存在于人和鼠整個肺組織，包括氣管、支氣管、肺泡和臟層胸膜，在整個氣管樹內皮構成一個完整的DCs網絡[7]。支氣管肺組織中的DCs是呼吸系統免疫環境中最重要的抗原提呈和免疫調節細胞，發揮免疫前哨監視和誘導特異性免疫應答反應的功能。有研究表明，急性肺損傷早期即存在肺部DCs數量和成熟程度的增加，并可能通過增強Th1型免疫應答及促炎性細胞因子的分泌啟動及加劇急性肺損傷早期肺部炎性反應[8]，且急性肺損傷時小鼠外周血DCs數量早期減少，隨后逐漸增多，功能呈漸成熟狀態[9]。尼古丁是香煙煙霧中具有免疫調節作用的物質，其多種功能是通過除中樞神經系統神經元以外的細胞上的尼古丁乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors,nAChR)來實現的。全身很多細胞均存在nAChR，如上皮細胞、淋巴細胞、肺泡巨噬細胞和嗜酸粒細胞[10]。在與煙草相關疾病的研究中，Ginzkey等[11]的研究發現nAChR、DNA損傷中的氧化應激反應與煙草相關癌癥具有相關性，而在尼古丁與DCs的眾多研究中均發現其可以改變DCs的生物活性[12]。李毅等[13]在大鼠哮喘模型研究中發現，尼古丁抑制DCs髓樣分化因子88(MyD88)以及白介素(IL)-10、IL-12的表達，降低DCs刺激淋巴細胞增殖的能力，從而削弱了DCs的抗原識別和提呈功能。

本研究以CD11c和S100蛋白作為大鼠支氣管肺組織DCs的標志物來研究不同香煙煙霧暴露時間對其肺臟DCs數量的影響。CD11c是分子量為150 kD的αX亞單位β2整合素家族成員，是確定DCs的特異性表面標志物之一，在大鼠髓系和淋巴系DCs，包括DCs前體、未成熟及成熟的DCs中均有較高的表達[14-15]。S100蛋白是一種氨基酸序列高度保守的、EF手型(螺旋2環2螺旋)的鈣結合蛋白，通過對鈣離子(Ca2+)的調節及與靶蛋白的相互作用，在體內發揮多種生物學作用。S100蛋白以Ca2+依賴的方式調控細胞內外的生理活動，部分S100蛋白被分泌到細胞外作用于白細胞，調控靶細胞的增殖，調節巨噬細胞和炎性細胞的活性。文獻報道S100蛋白可以標記所有成熟及未成熟的DCs[16]。本研究觀察到在炎性細胞浸潤明顯的支氣管、肺組織區域DCs分布增多，炎癥區域血管周圍可見大量的DCs分布，這可能與DCs從血液中遷徙而來有關，與Lommatzsch等[17]的研究結果一致。本研究結果顯示，隨著香煙煙霧暴露時間的延長，CD11c和S100蛋白標記陽性DCs數量增多，D組>C組>B組>A組，而E組CD11c和S100蛋白標記陽性DCs數量少于C組，但多于A組，進一步說明香煙煙霧暴露能夠誘導大鼠肺組織DCs數量增多，而且與暴露時間有關，戒煙后DCs數量減少。正常情況下肺部DCs數量十分稀少，不到肺實質細胞總數的1%。肺部DCs以未成熟的狀態廣泛分布于呼吸道上皮組織和黏膜下層中，氣道DCs的這種分布有利于其及時獲取和處理吸入抗原信息、維持氣道上皮屏障功能完整。當外源性抗原進入機體后，DCs通過巨胞飲、吞噬、受體介導的內吞作用攝取外源性抗原，抗原經過DCs處理后，形成抗原肽片段，可經主要組織相容性復合體(MHC)分子及CD1分子途徑得到有效的遞呈。氣道DCs在與吸煙相關性肺疾病中起著非常重要的作用。

本研究立足于香煙煙霧暴露對DCs數量的影響，并未就增多的DCs的來源做進一步研究，亦未對增多的DCs功能的改變做進一步了解，故將會在以后的研究中逐步深入。

總之，本研究結果表明香煙煙霧暴露可以導致大鼠肺組織DCs數量增加，且隨著香煙煙霧暴露時間的延長，DCs數量增多越明顯，戒煙后其數量有所減少。

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