正交試驗(yàn)優(yōu)選地榆總鞣質(zhì)提取工藝?

嚴(yán) 瑋，許建勇，姜曉燕，繆 婧

(1.南通市中醫(yī)院,南通 226001；2.蘇州大學(xué)，蘇州 215000)

地榆(Sanguisorba officinalis L.)為多年生薔薇科(Rosaceae)地榆屬(Sanguisorba L.)植物的草本植物，以根入藥。地榆中的鞣質(zhì)具有抑菌、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、免疫、抗腹瀉、抗病毒和降低尿毒癥毒素等多種藥理活性[1-3]，因此考察如何快速有效地提取地榆中鞣質(zhì)具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 試藥與儀器

1.1 工藝研究用藥材

地榆(批號(hào)120501)購于南通三越中藥飲片有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

T6 型新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)；1001 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司生產(chǎn)；AL104 型電子分析天平，梅特勒-托利多上海有限公司生產(chǎn)；沒食子酸對照品(批號(hào)110831-201204)，購自中國藥品生物制品檢定所，其他試藥均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總鞣質(zhì)的含量測定[4-5]

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對照品50 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，加水溶解稀釋至刻度，精密量取5 mL，置50 mL 棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度搖勻即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取地榆10 g粉碎，過 60目篩置于容器中，采用不同方法、按不同溶劑濃度、料液比、時(shí)間、溫度進(jìn)行提取、抽濾，合并濾液置于 250 mL 棕色容量瓶中，加水 150 mL放置過夜，超聲處理 10 min，放冷至室溫，加水至刻度、搖勻，靜置過夜，棄去初濾液 50 mL，精密量取續(xù)濾液 10 mL，置于 100 mL 棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度搖勻即得。加水定容至 200 mL 量瓶中即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取沒食子酸對照品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL，分別置于25 mL棕色量瓶中，分別加磷鉬鎢酸試液1 mL，依次精密加入12 mL 20%碳酸鈉溶液，加水稀釋至刻度搖勻，以水為空白，760 nm 處測定吸光度(Y)，以Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y=47.65X-0.085(r=0. 9994)，提示沒食子酸在1～10 μg/mL與Y呈良好線性關(guān)系。

2.1.4 樣品測定 按《中國藥典》2010 版附錄XB 鞣質(zhì)含量測定方法測定。①總酚含量：精密量取供試品溶液0.2 mL，置25 mL 棕色量瓶中，按 2. 1. 3 項(xiàng)下方法測定Y，計(jì)算總酚質(zhì)量濃度；②不被吸附的多酚含量：精密量取供試品溶液25 mL，加至已有干酪素0. 6 g 的100 mL具塞錐形瓶中，密塞置30 ℃水浴中保溫1 h，振搖取出放冷、搖勻，過濾棄初濾液，取續(xù)濾液0.2 mL置于25 mL 棕色量瓶，按2.1.3項(xiàng)下方法測定Y，計(jì)算不被吸附的多酚質(zhì)量濃度。根據(jù)公式計(jì)算：鞣質(zhì)含量=總酚量-不被吸附多酚含量。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液0. 2 mL，置 25 mL 棕色量瓶中，按2.1.3項(xiàng)下方法測定X，重復(fù)5次，RSD為0.10%，提示儀器精密度良好，操作平行穩(wěn)定。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取3份供試品溶液0.2 mL，分別準(zhǔn)確加入高、中、低3個(gè)劑量組的對照品，按 2.1.3項(xiàng)下方法測定X，計(jì)算加樣回收率96.62%，RSD為0.97%。

2.2 提取

2.2.1 正交試驗(yàn)[6-7]表2、3顯示，地榆的鞣質(zhì)在乙醇的水溶液中具有較好的溶解性，試驗(yàn)乙醇濃度、加溶劑倍數(shù)、回流時(shí)間和提取次數(shù)設(shè)計(jì)為4因素3水平，稱取地榆10 g，粉碎過60目篩，緊密稱定，按表1進(jìn)行提取，以總鞣質(zhì)含量為指標(biāo)進(jìn)行考察。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果(L9(34))

表3 方差分析表(SAS)

注：F臨界值F0.01(1,2)=99，F(xiàn)0.05(1,2)=19，*顯著

表2、3顯示，乙醇濃度為影響總鞣質(zhì)的主要因素，而回流時(shí)間、溶劑倍數(shù)和提取次數(shù)為次要因素，搭配A3C1B2D3。影響總鞣質(zhì)含量的主要因素排列為：乙醇濃度>回流時(shí)間>溶劑倍數(shù)>提取次數(shù)，即藥材加80%乙醇、溶劑10倍、回流2次，每次回流1 h。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 表4顯示，稱取10 g地榆4份，分別加80%乙醇回流1 h，溶劑10倍，回流2次，減壓回收溶劑。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

表5顯示，2批樣品中總鞣質(zhì)含量相近，略高于正交表中的最高含量，提示按正交試驗(yàn)篩選的最優(yōu)提取工藝基本穩(wěn)定、可行。

3 討論

本課題以地榆所含總鞣質(zhì)為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)篩選，參考2010 年版《中國藥典》1部附錄干酪素法，以沒食子酸做對照品制定標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定鞣質(zhì)含量[2]。本課題中測得地榆所含鞣質(zhì)7.2%，與文獻(xiàn)結(jié)果相似[8-9]。

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示,溫度對提取鞣質(zhì)的工藝影響并不大，因此未納入溫度的研究，與文獻(xiàn)結(jié)論相似[10]。相對乙醇，甲醇的溶解性較好[11]，純甲醇的提取效率最高，可能與甲醇穿透細(xì)胞能力較強(qiáng)有關(guān)。但考慮甲醇的安全性和大生產(chǎn)的可行性，鞣質(zhì)的極性較大，也可以溶解在水中，因此本課題針對不同濃度的乙醇水溶液作為受試溶劑進(jìn)行考察。

經(jīng)過正交設(shè)計(jì)得到地榆總鞣質(zhì)提取的最佳工藝，藥材加80%乙醇回流1 h，溶劑10倍，回流2次。按最佳工藝進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示總鞣質(zhì)的提取穩(wěn)定，溶劑采用乙醇溶液，此工藝適合于大生產(chǎn)提取地榆總鞣質(zhì)。

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