牛磺酸對HepG2細胞膽固醇水平的影響

張 珊，郭俊霞，張艷貞，張 靜，陳 文

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191）

牛磺酸對HepG2細胞膽固醇水平的影響

張 珊，郭俊霞，張艷貞，張 靜，陳 文*

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191）

目的：探討牛磺酸對人肝癌細胞HepG2總膽固醇（total cholesterol，TC）、游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）、膽固醇酯（cholesterol ester，EC）水平及對膽固醇代謝限速酶——膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）蛋白表達的影響。方法：在培養(yǎng)液中添加終濃度為0.1、1、10、20 mmol/L的牛磺酸，分別在培養(yǎng)24、48 h后測定細胞內(nèi)TC、FC及EC水平；在培養(yǎng)液中添加終濃度為20 mmol/L的牛磺酸，分別培養(yǎng)12、24、48、72 h后檢測CYP7A1蛋白表達水平。結(jié)果：1、10、20 mmol/L的牛磺酸均可使HepG2細胞內(nèi)TC、FC水平明顯下降，且與牛磺酸濃度呈正比，但EC水平在牛磺酸濃度達1 mmol/L后即不隨牛磺酸濃度的增加而進一步降低；培養(yǎng)48 h后HepG2細胞TC、FC水平的降低幅度大于24 h時；20 mmol/L牛磺酸使FC含量減少的作用強于對EC減少的作用；培養(yǎng)24 h后HepG2細胞中CYP7A1蛋白表達最強。結(jié)論：牛磺酸可增強CYP7A1蛋白表達，促進HepG2細胞內(nèi)的膽固醇代謝，膽固醇降低程度與牛磺酸濃度及作用時間相關(guān)，作用48 h的效果明顯優(yōu)于24 h，且牛磺酸主要是降低了細胞內(nèi)的FC水平。

牛磺酸；膽固醇；膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）；HepG2細胞

牛磺酸富含于海產(chǎn)品中，是一種結(jié)構(gòu)簡單的小分子含硫氨基酸。它主要以游離形式存在于哺乳動物的心臟、肝臟、視網(wǎng)膜等組織器官中，是蛋氨酸、半胱氨酸的代謝產(chǎn)物[1]。多年來，許多動物實驗已證明牛磺酸可以顯著降低飲食性高脂血癥大鼠、小鼠、豚鼠血清和肝臟的總膽固醇含量[2-6]，臨床實驗也顯示牛磺酸能有效降低志愿者的血清總膽固醇含量與動脈粥樣硬化指數(shù)，從而降低心腦血管疾病的發(fā)病風(fēng)險[7-8]。

雖然牛磺酸降膽固醇的體外研究報道不多，但有研究[9-11]顯示牛磺酸能夠增加人肝癌細胞HepG2和鼠肝癌細胞H4IIE的膽固醇降解限速酶——膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）mRNA水平，并降低HepG2細胞內(nèi)總膽固醇的含量。因此，本實驗擬以HepG2細胞為研究對象，探討牛磺酸對細胞內(nèi)總膽固醇（total cholesterol，TC）、游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）、膽固醇酯（cholesterol ester，EC）水平及CYP7A1蛋白表達的影響，以期為牛磺酸降膽固醇作用及其分子機制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2細胞 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心；DMEM培養(yǎng)基 美國HyClone公司；胎牛血清美國Gibco公司；膽固醇（純度≥99%）、牛磺酸（純度＞99%）、膽固醇氧化酶、辣根過氧化物酶、膽固醇酯水解酶、水合牛膽酸鈉、苯酚、4-氨基安替比林 美國Sigma公司；CYP7A1一抗（兔抗人H-58：sc-25536）、CYP7A1二抗（山羊抗兔IgG-HRP：sc-2004） 美國Santa Cruz公司；β-actin一抗（兔抗人） 美國GenView公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

uQuant Bio-Tek酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀 美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國通用公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及處理

HepG2細胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)10%）的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)，以1×105～2×105個/孔接種于6 孔板中。預(yù)實驗結(jié)果顯示，當(dāng)牛磺酸終濃度達到20 mmol/L時，細胞的存活率約為88%，終濃度達到30 mmol/L時，細胞的存活率不到70%，故本實驗中將牛磺酸的最大濃度設(shè)為20 mmol/L，即分別在培養(yǎng)基中添加終濃度為0.1、1、10、20 mmol/L的牛磺酸，并同時設(shè)置對照組，孵育24 h或48 h。

1.3.2 細胞內(nèi)膽固醇水平測定[12-13]

用磷酸鹽緩沖液沖洗細胞2 次，每孔細胞加入1 mL正己烷-異丙醇（2∶1，V/V），室溫下慢搖，以提取細胞內(nèi)脂類物質(zhì)。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液，通氮氣40 min除去有機溶劑，以含TritonX-100（體積分?jǐn)?shù)10%）的異丙醇130 μL振蕩溶解上述脂類提取物。

按照表1配制TC、FC測定工作液。取50 μL脂類提取物，分別加入TC和FC測定工作液，37 ℃水浴30 min，用酶標(biāo)儀于500 nm波長處測定吸光度。

表1 膽固醇測定工作液配制成分Table1 Preparation of working solutions for cholesterol detection

1.3.3 細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量測定

細胞完成脂類物質(zhì)提取后，加入裂解液冰上提取細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，4 ℃、10 000 r/min離心10 min。取上清液即為測試樣品，并以BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。

膽固醇含量以膽固醇與蛋白質(zhì)的比值（μg/mg pro）表示；膽固醇酯（EC）=TC－FC。

1.3.4 Western blotting法測定CYP7A1蛋白表達

用裂解液裂解細胞并收集蛋白質(zhì)，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉1 h，分別與CYP7A1抗體和內(nèi)參β-actin抗體4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液漂洗3 次后加入二抗，室溫孵育2 h。以ECL高效化學(xué)發(fā)光試劑曝光成像并經(jīng)ECL凝膠成像系統(tǒng)掃描。系統(tǒng)分析結(jié)果，分別計算各組CYP7A1與β-actin的灰度比值，代表每組CYP7A1的蛋白表達水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 牛磺酸對細胞膽固醇水平的影響

表2 不同濃度牛磺酸作用24 h對HepG2細胞TC、FC及EC水平的影響（±s，n＝6）Table2 Effect of taurine concentration on intracellular TC, FC and EC levels after 24 h culture (±s, n=6)

表2 不同濃度牛磺酸作用24 h對HepG2細胞TC、FC及EC水平的影響（±s，n＝6）Table2 Effect of taurine concentration on intracellular TC, FC and EC levels after 24 h culture (±s, n=6)

注：*. 與對照組相比顯著差異（P＜0.05）。下同。

μg/mg pro組別對照組牛磺酸添加量/（mmol/L）0.111020 TC含量232.1±11.9 231.8±11.9 216.7±9.7*207.4±8.2*195.9±9.1*FC含量161.9±10.8 162.2±10.4 152.6±9.2 143.9±8.1*133.7±9.6*EC含量70.2±4.869.6±3.364.0±5.9*63.6±3.5*62.1±3.5*

由表2可知，培養(yǎng)24 h后，0.1 mmol/L牛磺酸對HepG2細胞的TC、FC及EC水平無影響。當(dāng)牛磺酸濃度為1、10、20 mmol/L時，細胞TC水平均顯著低于對照組（P＜0.05），下降幅度分別為6.7%、10.7%、15.6%，EC水平也顯著低于對照組（P＜0.05），分別降低了8.8%、9.4%、11.5%。FC水平則下降了6.0%、11.2%（P＜0.05）、17.4%（P＜0.05）。由以上結(jié)果可知，細胞TC、FC水平的降低與牛磺酸濃度呈依賴關(guān)系，以牛磺酸濃度為20 mmol/L時膽固醇水平下降最多，EC水平則在牛磺酸達到1 mmol/L后不再隨牛磺酸濃度的增加而進一步降低。

表3 不同濃度牛磺酸作用48 h對HepG2細胞TC、FC及EC水平的影響（±s，n＝6）Table3 Effect of taurine concentration on intracellular TC, FC and EC levels after 48 h culture (±s, n=6)

表3 不同濃度牛磺酸作用48 h對HepG2細胞TC、FC及EC水平的影響（±s，n＝6）Table3 Effect of taurine concentration on intracellular TC, FC and EC levels after 48 h culture (±s, n=6)

μg/mg pro組別對照組牛磺酸添加量/（mmol/L）0.111020 TC含量236.6±4.2 227.3±4.5*204.2±5.6*184.0±5.7*172.4±7.0*FC含量170.7±7.4 163.4±4.6 151.3±8.9*131.3±5.6*111.6±6.9*EC含量65.9±6.864.0±5.152.9±7.9*52.7±9.9*60.8±7.9

由表3可知，添加不同濃度的牛磺酸作用48 h后，HepG2細胞TC、FC、EC水平均有不同程度的降低。牛磺酸濃度為0.1 mmol/L時，細胞TC水平減少了3.9%（P＜0.05）。當(dāng)牛磺酸濃度為1、10、20 mmol/L時，細胞TC水平均顯著低于對照組（P＜0.05），下降幅度分別為13.7%、22.2%、27.1%，F(xiàn)C水平也顯著低于對照組（P＜0.05），下降幅度分別為11.39%、23.11%、34.62%，EC水平則分別減少了20.0%（P＜0.05）、20.0%（P＜0.05）、8.0%。由以上結(jié)果可以看出，細胞TC、FC水平的降低與牛磺酸濃度呈正比，以牛磺酸濃度為20 mmol/L時膽固醇水平下降最多，但EC水平則在牛磺酸達到1 mmol/L后不再隨牛磺酸濃度的增加而進一步降低。

2.2 培養(yǎng)時間對細胞CYP7A1蛋白表達的影響

表4 不同培養(yǎng)時間對CYP7A1蛋白表達的影響（±s，n＝3）Table4 Effect of culture time on the protein expression of CYP7A1±s, n=3)

表4 不同培養(yǎng)時間對CYP7A1蛋白表達的影響（±s，n＝3）Table4 Effect of culture time on the protein expression of CYP7A1±s, n=3)

注：#. 與12、48、72 h組相比差異顯著（P＜0.05）。下同。

組別對照組20 mmol/L牛磺酸12 h24 h48 h72 h灰度比值0.41±0.070.74±0.05*1.58±0.02*#1.01±0.05*0.68±0.10*

圖1 不同培養(yǎng)時間對CYP7A1蛋白表達的影響Fig.1 Effect of culture time on the protein expression of CYP7A1

由2.1節(jié)結(jié)果可知，培養(yǎng)24、48 h，都是20 mmol/L外源性牛磺酸可最大程度降低細胞中膽固醇的水平。因此選擇20 mmol/L牛磺酸探討其對CYP7A1蛋白表達的影響。由表4、圖1可知，添加20 mmol/L牛磺酸分別作用12、24、48、72 h，CYP7A1的蛋白表達均較對照組顯著增強（P＜0.05），其中以作用24 h時效果最為明顯。

3 討 論

機體維持膽固醇平衡的3 條途徑分別是合成、降解、排出體外。膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）是膽固醇降解限速酶，是膽固醇降解為膽汁酸的關(guān)鍵酶，在膽固醇的代謝過程中起重要作用。

降低血清膽固醇是牛磺酸的重要生理功能之一。Yokogoshi等[14]研究結(jié)果顯示，飼料中添加5%的牛磺酸可使高脂膳食誘導(dǎo)的高膽固醇血癥大鼠肝臟CYP7A1 mRNA水平增加95%，并顯著降低血清TC水平。Murakami等[15]研究證實，對于高脂膳食誘導(dǎo)的高膽固醇血癥小鼠，長期給予牛磺酸可以促進膽固醇的降解，牛磺酸顯著提高了小鼠膽汁中牛磺膽酸的比例，增加了糞便中膽汁酸的排出。到目前為止，多個研究小組已通過大鼠、小鼠、豚鼠等動物實驗證明牛磺酸可以有效降低血清和肝臟中的膽固醇含量，提高肝臟CYP7A1的活性，并促進糞便中膽汁酸的排出，從而起到降低膽固醇和抗動脈粥樣硬化的作用[6,16-17]。

關(guān)于牛磺酸對膽固醇代謝的影響大多是在整體動物水平上進行研究的，體外研究報道不多。HepG2細胞保留了正常人體肝細胞的多種生理特性[18-20]，因此牛磺酸降膽固醇作用的體外研究多以HepG2細胞為模型。Yanagita等[10]研究指出，在DMEM培養(yǎng)基中添加10－3mol/L牛磺酸，培養(yǎng)24 h后HepG2細胞內(nèi)膽固醇水平下降約19%，膽固醇酯的合成受到抑制。Lam等[9]研究表明，無論細胞是否在高膽固醇條件下培養(yǎng)，牛磺酸都會顯著提高HepG2細胞CYP7A1 mRNA水平，促進膽固醇的降解。而Hoang等[11]曾用大鼠肝癌細胞H4IIE探討了牛磺酸對膽固醇代謝的影響，結(jié)果顯示在MEM培養(yǎng)基中添加10－4mol/L牛磺酸，H4IIE細胞的CYP7A1 mRNA水平增加了3 倍之多，也表明牛磺酸通過提高CYP7A1表達而促進膽固醇降解。

細胞內(nèi)膽固醇以游離和酯化兩種形式存在，但是到目前為止，未見有在細胞水平系統(tǒng)研究牛磺酸對細胞內(nèi)TC、FC、EC水平及CYP7A1表達影響的報道。因此，本實驗以HepG2細胞為對象，探討了牛磺酸對細胞內(nèi)TC、FC、EC水平及CYP7A1蛋白表達水平的影響。結(jié)果顯示，細胞內(nèi)的TC由2/3的FC和1/3的EC組成，1、10、20 mmol/L的牛磺酸均可使HepG2細胞TC、FC水平明顯下降，且與牛磺酸濃度呈正比；從培養(yǎng)時間上看，添加牛磺酸對細胞培養(yǎng)48 h，TC、FC的降低幅度遠遠大于培養(yǎng)24 h，表明培養(yǎng)48 h作用時間充分，牛磺酸的降膽固醇效果更好；但無論培養(yǎng)24 h還是48 h，細胞EC水平則在牛磺酸達到1 mmol/L后就不再隨牛磺酸濃度的增加而進一步降低；當(dāng)牛磺酸濃度為20 mmol/L時，無論培養(yǎng)24 h還是48 h，細胞FC水平的降低都遠遠大于EC，表明牛磺酸降膽固醇作用主要是通過降低細胞內(nèi)FC水平而實現(xiàn)的。以上結(jié)果提示，牛磺酸可以促進HepG2細胞膽固醇水平下降，且降低程度與外源性牛磺酸濃度及作用時間相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，膽固醇水平的降低程度與牛磺酸濃度呈正比，作用48 h的效果明顯優(yōu)于24 h，且牛磺酸降膽固醇作用主要是降低了細胞內(nèi)FC的水平。

依據(jù)20 mmol/L外源性牛磺酸可最大程度降低細胞中膽固醇水平的結(jié)果，選定20 mmol/L牛磺酸，采用Western blotting方法測定了其對CYP7A1蛋白表達的影響。結(jié)果顯示，添加20 mmol/L牛磺酸培養(yǎng)24 h時，細胞CYP7A1的表達最強，這與Lam等[9]的研究結(jié)果基本一致。結(jié)合以上結(jié)果，牛磺酸作用48 h的降膽固醇作用要明顯強于作用24 h，這可能是由于CYP7A1蛋白在合成后需經(jīng)過后加工成為成熟的蛋白質(zhì)以及其充分發(fā)揮降膽固醇作用都需要一定的時間才能完成所致。因此，雖然牛磺酸作用24 h使細胞內(nèi)CYP7A1蛋白表達最強，但其降膽固醇作用在48 h時才能更好顯現(xiàn)。

綜上所述，牛磺酸可以增強HepG2細胞中CYP7A1蛋白的表達，20 mmol/L牛磺酸作用24 h時其表達最強；CYP7A1的表達促進了細胞內(nèi)膽固醇的代謝，膽固醇降低程度與牛磺酸濃度及作用時間相關(guān)，作用48 h的效果明顯優(yōu)于24 h，且牛磺酸降膽固醇作用主要體現(xiàn)為降低了細胞內(nèi)FC的水平。

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Effect of Taurine on Cholesterol Level of HepG2 Cells

ZHANG Shan, GUO Jun-xia, ZHANG Yan-zhen, ZHANG Jing, CHEN Wen*
(College of Applied Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Objective: To study the effect of taurine on total cholesterol (TC), free cholesterol (FC) and cholesterol ester (EC) levels as well as the protein expression of the rate-limiting enzyme CYP7A1 involved in cholesterol metabolism in HepG2 cells. Methods: The levels of intracellular TC, FC and EC were determined after the cells were cultured for 24 and 48 h in DMEM supplemented with taurine at final concentrations of 0.1, 1, 10 and 20 mmol/L, respectively. The protein expression of CYP7A1 was detected after the cells were cultured for 12, 24, 48 and 72 h in DMEM with 20 mmol/L taurine. Results: The levels of intracellular TC and FC declined obviously after culture in the presence of 1,10 and 20 mmol/L taurine, suggesting a positive dose-effect relationship, but EC levels did not continue to decrease when the taurine concentration exceeded 1 mmol/L. A more pronounced decrease in intracellular TC and FC was observed when the culture time was prolonged from 24 to 48 h. Intracellular FC was reduced to a greater extent by 20 mmol/L taurine than intracellular EC. The highest protein expression of CYP7A1 was noted after 24 h culture. Conclusion: Taurine can enhance CYP7A1 expression and promote intracellular cholesterol metabolism, and the decrease of cholesterol is associated with taurine concentration and action duration, showing a superior effect at 48 h than at 24 h, and its main benefit is reducing intracellular FC.

taurine; cholesterol; cholesterol 7α-hydroxylase (CYP7A1); HepG2 cells

TS201.4

A

1002-6630（2014）23-0284-04

10.7506/spkx1002-6630-201423055

2014-06-27

北京市自然科學(xué)基金項目（5142004）；北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室開放課題（Zk70201404）

張珊（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)與功能。E-mail：zhang.shan12@163.com

*通信作者：陳文（1966—），女，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與功能。E-mail：wlchenwen@buu.edu.cn